الشيلاجيت: الفوائد والاستخدامات والتركيبات والمكونات والطريقة والجرعة والآثار الجانبية

 

تستمر الأجسام المضادة لـ SARS-CoV-2 لعدة أشهر بعد الإصابة

الاصابة بفيروس كورونا المستجد قد تؤدي الى مناعة طويلة الامد، وفقا لدراسة جديدة. استخدم الباحثون اختبار حساس يكشف الاجسام المضادة حتى بعد عدة اسابيع من العدوى. 

سلطت دراسات سابقة الضوء على ان المناعة قد تستمر لبضعة اسابيع، لكن هذه الدراسة الجديدة التي استخدمت منهجا مختلفا اظهرت ان الاجسام المضادة قد تستمر في الجسم لبضعة اشهر.

هام: هذا لا يعني انك يجب ان تمضي قدما وتصيب نفسك بالعدوى.

 كبداية، ليس كل مريض كوفيد 19 يطور هذا النوع من المناعة.

 فقط بعض الناس يفعلون لان هذا يعتمد على جيناتنا وقوة جهازنا المناعي. 

ايضا، يتلاشى نشاط هذه الاجسام المضادة مع مرور الوقت. 

من غير المحتمل ان هؤلاء المرضى طوروا ذاكرة ضد الفيروس، مما يعني ان العدوى لا تزال ممكنة. 

وبالتالي، فان اللقاح هو حلنا النهائي الوحيد ضد هذا الوباء.

استمرار وانحلال استجابات الأجسام المضادة البشرية لمجال ربط المستقبلات لبروتين ارتفاع SARS-CoV-2 في مرضى COVID-19

قمنا بقياس استجابات البلازما و / أو الأجسام المضادة في المصل لمجال ربط المستقبلات (RBD) لبروتين السارس (S) الخاص بـ SARS-CoV-2 في 343 

مريضًا من أمريكا الشمالية مصابين بـ SARS-CoV-2 (من بينهم 93٪ تطلب دخول المستشفى ) حتى 122 يومًا بعد ظهور الأعراض ومقارنتها باستجابات 1548 فردًا تم الحصول على عينات دمهم قبل الجائحة. 

بعد تحديد عتبات الإيجابية المصلية للنوعية المثالية (100٪) ، قدرنا الحساسيات بنسبة 95٪ لـ IgG و 90٪ لـ IgA و 81٪ لـ IgM للكشف عن الأفراد المصابين بعد 15 إلى 28 يومًا من ظهور الأعراض. 

في حين أن متوسط ​​الوقت للتحول المصلي كان ما يقرب من 12 يومًا عبر جميع الأنماط النظيرية الثلاثة التي تم اختبارها ، فإن الأجسام المضادة IgA و IgM ضد RBD كانت قصيرة العمر مع متوسط ​​أوقات الانقلاب المصلي 71 و 49 يومًا بعد ظهور الأعراض.

 على النقيض من ذلك ، تلاشت استجابات IgG المضادة لـ RBD ببطء خلال 90 يومًا مع 3 أفراد فقط مصابين بالمصل انعكسوا خلال هذه الفترة الزمنية. 

ارتبطت الأجسام المضادة IgG لـ SARS-CoV-2 RBD ارتباطًا وثيقًا بعيارات الأجسام المضادة المعادلة لـ S ، والتي أظهرت انخفاضًا طفيفًا أو معدومًا على مدار 75 يومًا منذ ظهور الأعراض. 

لم نلاحظ أي تفاعل متقاطع للأجسام المضادة المستهدفة لـ SARS-CoV-2 RBD مع فيروسات كورونا الأخرى المنتشرة على نطاق واسع (HKU1 ، 229 E ، OC43 ، NL63). 

تشير هذه البيانات إلى أن الأجسام المضادة المستهدفة لـ RBD هي علامات ممتازة للعدوى السابقة والحديثة ، وأن قياسات النظائر التفاضلية يمكن أن تساعد في التمييز بين العدوى الحديثة والأقدم ، وأن استجابات IgG تستمر خلال الأشهر القليلة الأولى بعد الإصابة وترتبط بشكل كبير مع الأجسام المضادة المعادلة.

انتشر فيروس كورونا 2 المتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة (SARS-CoV-2) ، العامل المسبب لمرض فيروس كورونا 2019 (COVID-19) ، بسرعة في جميع أنحاء العالم منذ تحديده لأول مرة في ووهان ، الصين ، في ديسمبر 2019 (1). في 11 مارس 2020 ، أعلنت منظمة الصحة العالمية (WHO) أن كوفيد -19 أصبح وباءً ، حيث تجاوز عدد الوفيات العالمية المبلغ عنها مليون حالة وفاة في 28 سبتمبر 2020 (2).

في الوقت الحالي ، فإن فهمنا لاستجابات الأجسام المضادة بعد الإصابة بـ SARS-CoV-2 محدود (3-5). 

على وجه التحديد ، نحن نفتقر إلى الأوصاف التفصيلية والتقديرات الدقيقة المتعلقة بحجم ومدة الاستجابات ، والتفاعل المتبادل مع فيروسات كورونا الأخرى ومسببات الأمراض التنفسية الفيروسية ، وعلاقات المناعة الوقائية بعد العدوى. 

هناك حاجة إلى توصيف مفصل لاستجابات الجسم المضاد لتحديد ما إذا كانت الاختبارات القائمة على الأجسام المضادة يمكن أن تزيد من الاختبارات القائمة على الكشف عن الفيروس في تشخيص العدوى النشطة أو الحديثة ولإبلاغ تصميم وتفسير الدراسات الوبائية المصلي.

في هذه الدراسة ، قمنا بتمييز الخواص الحركية والنمط النظري للجسم المضاد إلى مجال ربط المستقبل (RBD) لبروتين السنبلة (S) لـ SARS-CoV-2 في مجموعة طولية من مرضى أمريكا الشمالية المصابين بفيروس SARS-CoV-2 ، ومعظمهم تم نقلهم إلى المستشفى بسبب COVID-19 ، وفي ضوابط ما قبل الجائحة. 

لقد درسنا أيضًا مدى ارتباط هذه الاستجابات مع نشاط الجسم المضاد المعادل الموجه إلى بروتين S. بالإضافة إلى ذلك ، قمنا بتقييم التفاعل المتبادل لهذه الاستجابات مع فيروس كورونا RBDs الأخرى ووصفنا أداء الفحص باستخدام بقع الدم المجففة كبديل للمصل أو البلازما.

باستخدام مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم في المنزل (ELISA) ، قمنا بقياس استجابات الأجسام المضادة لـ RBD في مجموعتين:

 1) المرضى الذين ظهرت عليهم أعراض إيجابية لـ SARS-CoV-2 بواسطة PCR (العدد = 343) و

 2) الأصحاء (n = 1،515) وضوابط الحمى (ن = 33) جمعت قبل جائحة SARS-CoV-2. 

كانت غالبية الحالات الإيجابية لـ SARS-CoV-2 شديدة (93٪ في المستشفى ، 53٪ تتطلب رعاية على مستوى وحدة العناية المركزة ، 13٪ ماتوا) ، ذكر (62٪) ، وكبار السن (متوسط ​​العمر: 59) (الجدول 1 ، الشكل S1) . 

كانت معظم الضوابط السابقة للوباء أصغر سنًا (متوسط ​​العمر: 37) والإناث (66٪).

تم جمع البلازما و / أو المصل في نقاط زمنية متعددة لمعظم المرضى (63 ٪ ؛ ن = 216) ، مع 34 ٪ (ن = 118) لديهم 4 عينات. 

تم جمع عينة من 42٪ من الحالات بين 0-7 أيام بعد ظهور الأعراض (العدد = 143) ، 55٪ كانت العينة بين 8-14 يومًا (العدد = 189) ، 48٪ كانت العينة بين 15-28 يومًا (ن = 165) ، كان لدى 35 ٪ عينة بين 29-45 يومًا (ن = 121) ، وكان 22 ٪ لديهم عينة بين 46-60 يومًا (ن = 76) ، و 10 ٪ لديهم عينة> 60 يومًا (ن = 76) = 35). 

تم جمع العينة الأخيرة بعد 122 يومًا من ظهور الأعراض. 

ستة وعشرون (8٪) حالة كانت مناعية (على سبيل المثال ، ميثوتريكسات ، ريتوكسيماب ، إلخ) ، ولم نتوقع منهم أن يشكلوا استجابة مناعية قوية.

حركية استجابات الأجسام المضادة لـ SARS-CoV-2 RBD

إذا تم اتباعها لأكثر من 14 يومًا منذ ظهور الأعراض ، فإن معظم الحالات (92٪) لديها قياس IgG واحد على الأقل أعلى مما لوحظ في أي سيطرة ما قبل الجائحة (الشكل 1). 

من الأيام 5 إلى 14 ، كان هناك ارتفاع حاد في الأجسام المضادة الخاصة بـ RBD لجميع الأنماط النظيرية ، واستمرت قياسات IgG في الارتفاع حتى اليوم 25 بعد ظهور الأعراض (الشكل S2A). 

بلغ متوسط ​​استجابات IgA و IgM ذروتها قبل أقل من أسبوع من IgG ثم انخفض نحو التركيزات التي تم قياسها في عينات ما قبل الجائحة (الشكل S2 و S3). 

بدأت استجابات الأجسام المضادة IgG في التضاؤل ​​أيضًا ، ولكن بمعدل أبطأ. 

من بين 117 حالة مع قياسات ≥ 4 ، حدث قياس ذروة IgM الفردي غالبًا قبل قياس IgG (قبل: 55٪ ، متزامن: 38٪) وفي نفس الوقت مع IgA (قبل: 28٪ ، متزامن: 53٪).

 بين المرضى في المستشفى ، كان متوسط ​​مسار السكان يختلف قليلاً بين مستويات الشدة ؛ كان متوسط ​​تركيزات IgG بين الحالات في المستشفى التي تم إدخالها إلى وحدة العناية المركزة أعلى من الحالات في المستشفى التي لم يتم قبولها في وحدة العناية المركزة (الشكل S2B). 

كانت تركيزات جميع الأنماط المتماثلة أقل بين الأفراد الذين يعانون من كبت المناعة (الشكل S2C).

1 قياس IgG، IgM، IgA مقابل مجال ربط مستقبلات بروتين السارس- CoV-2 بين الضوابط السابقة للجائحة والحالات الإيجابية لـ PCR.

تمثل كل نقطة قياسًا فريدًا للنمط المتماثل (الصف A: IgG ، والصف B: IgM ، والصف C: IgA) في عناصر التحكم السابقة للوباء (اللوحات اليسرى) والحالات الإيجابية لـ PCR (اللوحات اليمنى). الخط الأزرق هو دالة غير معلمية ناعمة. تشير الخطوط المتقطعة السوداء إلى أقصى تركيز (ميكروغرام / مل) موجود بين عناصر التحكم في فترة ما قبل الجائحة (IgG: 0.57 ، IgM: 2.63 ، IgA: 2.02). تم إدخال الارتعاش الأفقي في ضوابط ما قبل الجائحة. كان حد الكشف (ميكروغرام / مل) 0.04 لـ IgG و 0.28 لـ IgM و 0.30 لـ IgA.

دقة الأجسام المضادة لـ RBD لتحديد عدوى SARS-CoV-2 الحديثة

كان كل نمط نظري للجسم المضاد مؤشراً على الإصابة ، وزادت المنطقة الواقعة تحت منحنى تشغيل المستقبل (AUC) لكل نمط نظري للجسم المضاد إلى ما يزيد عن 98٪ خلال فترة 15-28 يومًا بعد ظهور الأعراض (الجدول 2). 

ظل AUC مرتفعًا لـ IgG (99٪) و IgA (98٪) بعد 28 يومًا ولكنه بدأ في الانخفاض لـ IgM (93٪).

 باستخدام حدود الاختبار المحددة لضمان عدم وجود نتائج إيجابية خاطئة في عينات ما قبل الجائحة (أي 100٪ ضمن خصوصية العينة) ، وجدنا أن حساسية الأجسام المضادة IgG ارتفعت من 7٪ (7 أيام) إلى 95٪ بعد 14 يومًا من الأعراض .

 ارتفعت حساسية IgA و IgM إلى 90٪ و 81٪ 2-4 أسابيع بعد ظهور الأعراض لكنها انخفضت بعد 4 أسابيع إلى 66٪ و 44٪ على التوالي. 

من خلال التحقق المتقاطع من عشرة أضعاف ، وجدنا أن متوسط ​​الخصوصية لكل نمط إسوي كان 99.9٪ (النطاق الخاص بالطي: 99.4 - 100٪).

الجمع بين عدة قياسات متساوية لتحسين الدقة

وجدنا أنه يمكن تحسين دقة التحديد المصلي للعدوى الحديثة بشكل طفيف عن طريق إضافة قياسات IgM و / أو IgA إلى IgG في المراحل السابقة من العدوى (الجدول S2 ؛ الشكل S4).

 باستخدام نماذج الغابة العشوائية للجمع بين قياسات الأنماط المختلفة ، قدرنا cvAUC بنسبة 92٪ لـ IgG & IgM و 91٪ لـ IgG & IgA في 8-14 يومًا بعد ظهور الأعراض. 

توفر هذه النماذج تقديرًا لمساهمة كل نمط نظري للجسم المضاد ، بالإضافة إلى تقريب للقيمة التنبؤية القصوى للقياسات المجمعة لاستجابات IgG و IgA و IgM المضادة لـ RBD. في حين أن جميع الأنماط المتساوية ساهمت بشكل متساوٍ تقريبًا في تحديد ملامح الأجسام المضادة للعدوى الحديثة في المرحلة المبكرة من المرض ، 

كانت استجابات IgG هي الأكثر دلالة على الإصابة بعد 8 أيام أو أكثر من ظهور الأعراض (الشكل S5).

 باستخدام العتبات المحددة مسبقًا للإيجابية المصلية لكل نمط نظري للجسم المضاد ، من بين 357 عينة تم جمعها أثناء العدوى المبكرة (أقل من 14 يومًا بعد ظهور الأعراض) ، تمكنا من تحديد 19 حالة إضافية (5٪) بشكل صحيح بين العينات السلبية IgG بإضافة IgM ، 21 (6٪) بإضافة IgA ، و 33 (9٪) بإضافة كل من IgM و IgA. 

عند حساب عدم توازن الفئة في إجراء الغابة العشوائية ، تم الحصول على نتائج مماثلة (الشكل S6 ، الشكل S7).

تقدير الوقت للانقلاب المصلي والانقلاب المصلي لكل نمط نظري

باستخدام القطع المحددة مسبقًا ، قدرنا توزيع الوقت المطلوب لتصبح مصلًا (الانقلاب المصلي) والعودة إلى أن تصبح سلبيًا (الانقلاب المصلي). بشكل عام ، خضع 324 (94٪) فردًا لأكثر من قياس واحد لكل 28 يومًا من المتابعة. 

من بين 159 حالة مع عينات بعد 20 يومًا من ظهور الأعراض ، كان لدى معظمها دليل على الانقلاب المصلي لجميع الأنماط النظيرية (IgG: 96٪ ، IgM: 88٪ ، IgA: 89٪). 

كان متوسط ​​الوقت المقدر للتحول المصلي من بداية الأعراض قابلاً للمقارنة عبر النمط النظري للجسم المضاد: 

10.7 يومًا (95 ٪ CI: 9.6-11.9) لـ IgG ، 11.7 يومًا (10.4-13.0) لـ IgA و 11.9 (10.5-13.4 يومًا) لـ IgM (الشكل 2). في المتوسط ​​، قدرنا متوسط ​​الوقت للتحول المصلي بين المرضى في المستشفى ليكون قبل أربعة أيام مقارنة بالمرضى غير المودعين في المستشفى لجميع الأنماط النظيرية ؛

 الرجال وأولئك الذين تقل أعمارهم عن 65 عامًا تحولوا مصليًا بسرعة أكبر في المتوسط ​​(الجدول S3).

الارتباط بين استجابات RBD وتطوير الأجسام المضادة المعادلة التي تستهدف بروتين S.

قمنا بقياس الأجسام المضادة المعادلة الكاذبة التي تستهدف بروتين SARS-CoV-2 S في 88 عينة من 15 فردًا تم جمعها بين 0 و 75 يومًا بعد ظهور الأعراض (الشكل 3). 

على مدار العدوى ، طور جميع الأفراد الذين تم اختبارهم أجسامًا مضادة محايدة يمكن اكتشافها (NAb). 

ارتبط عيار NAb بتركيز مضاد IgG المضاد لـ RBD (r = 0.87). من الجدير بالذكر ، على غرار استجابات IgG المضادة لـ RBD ، استقر عيار NAb وظل قابلاً للاكتشاف في نقاط زمنية لاحقة على الرغم من الانخفاض السريع في استجابات IgA و IgM.

الشكل 2: تقديرات النموذج البارامترية واللامعلمية للوقت للانقلاب المصلي والانقلاب المصلي لكل نمط متساوي.

أ) كانت حدود النمط المتماثل التي تم اختيارها للتحول المصلي هي أقصى تركيز (ميكروغرام / مل) وجد بين عناصر التحكم في فترة ما قبل الجائحة (IgG: 0.57 ، IgM: 2.63 ، IgA: 2.02). يمثل الخط الصلب دالة التوزيع التراكمي المقدرة للوقت إلى الانقلاب المصلي أو الارتداد مع 100 نوبة تمهيدية موضحة كخطوط شفافة. تفترض نماذج وقت الفشل المتسارع البارامترية توزيع الوقت إلى الحدث بسجل عادي. تم حساب التقديرات غير المعلمية الموضحة باللون الرمادي باستخدام طريقة Turnbull. تم إرجاع 3 أفراد فقط من أجل IgG ، لذلك لم يتم تضمين أي نموذج. ب) يشير الجدول إلى متوسط ​​عدد الأيام المقدر منذ ظهور الأعراض التي تستغرقها النسبة المئوية للحالات للتحول المصلي أو المصلي. يتم عرض فترات الثقة 95٪ Bootstrap بين قوسين.

تقييم التفاعل المتبادل مع الفيروسات التاجية الأخرى

قمنا بتقييم استجابات الأجسام المضادة لـ RBDs المستمدة من بروتينات سبايك لفيروسات كورونا البشرية المتوطنة (CoVs) (أي HKU1 و 229E و OC43 و NL63) وفيروس كورونا المتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة (SARS-CoV-1) ومتلازمة الشرق الأوسط التنفسية التاجية (MERS) -CoV) (الشكل S8). 

كانت استجابات الجسم المضاد للفيروسات المتوطنة قابلة للمقارنة بين الضوابط السابقة للوباء والأفراد المصابين بـ COVID-19 في جميع مراحل العدوى ، مما يدل على نقص التفاعل المتبادل. 

على الرغم من أن عددًا قليلاً من الأفراد المصابين بعدوى SARS-CoV-2 لديهم مستويات متزايدة من الأجسام المضادة لفيروسات كورونا المستوطنة بمرور الوقت ، وهو ما يمكن تفسيره من خلال الاستجابات المضحكة التفاعلية / الذاكرة المناعية ، إلا أن الغالبية ظلت كما هي. 

وبالتالي ، بشكل عام ، لم نلاحظ استجابة تفاعلية يمكن اكتشافها ضد RBDs لفيروسات كورونا البشرية المستوطنة عبر مجموعة الأفراد المصابين بـ SARS-CoV-2. 

في المقابل ، لاحظنا تفاعلًا متصالبًا كبيرًا مع SARS-CoV-1 RBD في الأفراد المصابين بـ COVID-19 ، ولكن لم تكن هناك استجابات تفاعلية متبادلة مهمة لـ MERS-CoV RBD. 

تجدر الإشارة إلى أنه كانت هناك ثلاث ضوابط لمرحلة ما قبل الجائحة (العينات التي تم جمعها قبل أكتوبر 2019) مع تفاعل تفاعلي بالغلوبولين المناعي أ مع فيروس السارس -1.

مقارنة استجابات البلازما لبقع الدم الجافة (DBS)

نظرًا لأنه يمكن استخدام DBS في المسوح المصلية الكبيرة حيث قد يكون الدم الوريدي صعبًا من الناحية اللوجستية في التجميع والمعالجة ، قمنا أيضًا بتقييم الفحص باستخدام محاكاة بقعة الدم المجففة في مجموعة فرعية من المرضى (n = 20 عند نقطتين زمنيين ؛ 40 عينة) وقبل الضوابط الوبائية (ن = 20).

 كان للقياسات المضادة لـ RBD IgG DBS درجة عالية من الارتباط الخطي في كلتا الحالتين وبلازما التحكم (r = 0.99 ، الشكل S9). بينما كان تصنيف جميع العينات هو نفسه بين عينات DBS وعينات البلازما (توافق تصنيف 100 ٪) ، تباعدت القيم بين نوعي العينات أكثر عند قيم عيار منخفضة.

الشكل 3 عيار الأجسام المضادة لتحييد الفيروس الكاذب SARS-CoV-2 في الحالات الإيجابية لـ PCR والارتباط مع استجابات IgG المضادة لـ RBD.

أ) كل نقطة تمثل قياس 50٪ عيار التعادل (NT50). تربط الخطوط القياسات من نفس الفرد وتظهر وظيفة اللوس السلسة باللون الأزرق. ب) يظهر معامل ارتباط القياسات المتكررة الشاملة (r). تمثل الخطوط نماذج خطية بسيطة لكل فترة زمنية

نقاش

في هذه الدراسة ، وجدنا أن الأجسام المضادة ضد منطقة RBD لبروتين S كانت مؤشرات دقيقة لعدوى SARS-CoV-2 الشديدة الحديثة. 

كان وجود الأجسام المضادة IgG التي تستهدف SARS-CoV-2 RBD علامة حساسة للغاية (95 ٪) للعدوى بعد 14 يومًا من بداية المرض.

 يتوافق هذا مع مجموعة متزايدة من البيانات التي توضح أن قياس الأجسام المضادة لـ RBD يمكن أن يصنف بدقة الأفراد المصابين حديثًا بفيروس SARS-CoV-2 (6-9). نظرًا لأن هذه الدراسة أجريت على مجموعة كبيرة من الأفراد المصابين بعدوى SARS-CoV-2 المعروفة (N = 343) والضوابط (N = 1548) ، فإنها توفر مقياسًا قويًا لدقة الأجسام المضادة لـ RBD.

تضيف هذه النتائج أيضًا إلى الأدلة الناشئة على استمرار وانحلال استجابات الأجسام المضادة بعد الإصابة بـ SARS-CoV-2.

 كانت استجابات IgM و IgA لـ RBD قصيرة العمر ومعظم الأفراد ارتدوا مصليًا في غضون شهرين ونصف بعد ظهور المرض.

 ومع ذلك ، استمرت الأجسام المضادة IgG عند مستويات يمكن اكتشافها في المرضى بعد 90 يومًا من ظهور الأعراض ، ولم يلاحظ الانقلاب المصلي إلا في نسبة صغيرة من الأفراد. 

كان تركيز الأجسام المضادة IgG المضادة لـ RBD أيضًا مرتبطًا بشكل كبير مع عيار الفيروس الكاذب NAb ، والذي أظهر أيضًا تسوسًا ضئيلًا. 

إن ملاحظة أن IgG واستجابات الأجسام المضادة المعادلة مستمرة مشجعة ، وتقترح تطوير ذاكرة مناعية جهازية قوية لدى الأفراد المصابين بعدوى شديدة. 

هذا مشابه لدراسة أجريت على أجسام مضادة لـ RBD في 121 متبرعًا بالبلازما في أمريكا الشمالية حتى 82 يومًا من ظهور الأعراض (10) ودراسة على 1197 آيسلنديًا ظلوا إيجابيين من خلال 2 من الأجسام المضادة لـ Pan-IgG SARS-CoV-2 المقايسات بعد 120 يومًا من تشخيص qPCR لـ SARS-CoV-2 (9). 

ومع ذلك ، تختلف هذه النتائج مع الدراسات الحديثة الأخرى التي تشير إلى تضاؤل ​​أسرع في التتر المضاد لـ RBD بعد عدوى خفيفة أو بدون أعراض SARS-CoV-2 (11 ، 12).

يعد الكشف المستند إلى RT-PCR عن SARS-CoV-2 حساسًا في وقت مبكر من الأسبوع الأول بعد ظهور الأعراض (13) ، وتشير نتائجنا إلى أن اكتشاف الأجسام المضادة ضد SARS-CoV-2 RBD بواسطة ELISA ، 

حتى عند الاستخدام من غير المرجح أن تساهم جميع الأنماط المتماثلة بشكل كبير في التشخيص المبكر لـ COVID-19.

 ومع ذلك ، بعد أسبوعين من ظهور الأعراض ، فإن استكمال فحوصات الكشف الفيروسي بطرق الاختبار القائمة على الأجسام المضادة يزيد بشكل واضح الحساسية في تشخيص العدوى الحديثة (14 ، 15) ،

 لا سيما مع تضاؤل ​​حساسية RT-PCR لعدوى SARS-CoV-2 (12) ). 

على وجه الخصوص ، توضح نتائجنا أن الانعكاس المصلي السابق لاستجابات IgA و IgM سيكون مفيدًا في التمييز بين الإصابات القديمة والحديثة. 

وبالتالي ، من المرجح أن يكون قياس الأنماط المتشابهة المتعددة ، مع الأخذ في الاعتبار التحلل المبكر لـ IgA و IgM ، حاسمًا في تفسير نتائج المسوح المصلي والدراسات الوبائية لتقدير الوقت المستغرق من الإصابة. 

جميعًا ، تشير هذه النتائج إلى تطبيقات محددة بوضوح للاختبار المصلي لاستجابات RBD في كل من الإعدادات السريرية / الصحة العامة / المراقبة.

يمكن أيضًا تطبيق اختبار الأجسام المضادة لـ SARS-CoV-2 RBD في دراسات علم الوبائيات المصلي ، حتى في المناطق ذات الانتشار المنخفض ، نظرًا لخصائصها الممتازة والحركية المحددة. 

أدى التباين في أداء الاختبارات المصلية التجارية والارتباك حول دور الأجسام المضادة كمؤشرات حيوية للعدوى السابقة مقابل المناعة الوقائية إلى سوء فهم واسع الانتشار بأن اختبار الأجسام المضادة قد يكون غير دقيق (16 ، 17). 

في المقابل ، يجب أن توفر دراستنا ، المستندة إلى عينة كبيرة جدًا من الحالات والضوابط ، ثقة كبيرة في مساهمة التدابير المصلية في جهود الصحة العامة لتحسين التحقيقات الوبائية (18) وتقديم تقديرات عالية الدقة لحدوث العدوى عبر المناطق الجغرافية. والسكان. 

بالإضافة إلى ذلك ، فإن عدم وجود تفاعل متقاطع للأجسام المضادة لـ SARS-CoV-2 RBD مع فيروسات كورونا الباردة الشائعة يوفر بيانات إضافية تدعم خصوصية الفحص.

كان أحد قيود دراستنا هو أن مجموعة الأفراد المصابين بعدوى SARS-CoV-2 كانت مائلة تجاه البالغين المصابين بمرض حاد أو مع عوامل خطر لتطور المرض. 

من المهم دراسة العوامل الحركية وعلى وجه الخصوص تحلل استجابات الأجسام المضادة لدى الأفراد المصابين بعدوى شديدة لعدة أسباب. 

أولاً ، من المحتمل أن يوفر حجم ومدة الاستجابات لدى الأفراد المصابين بعدوى شديدة تقديرًا للحدود العليا للاستجابة المناعية التي يمكن تحقيقها وتطور ذاكرة الخلايا البائية بعد الإصابة الطبيعية. 

ثانيًا ، من المتوقع أن يكون لهذه النتائج آثار كبيرة على المناعة الوقائية في مجموعة سكانية معرضة بشكل واضح لنتائج سيئة عند تعرضها. 

ومع ذلك ، يجب توخي الحذر عند تعميم هذه النتائج على المصابين بعدوى أقل حدة. 

لقد ثبت أن الأفراد المصابين بعدوى خفيفة أو بدون أعراض يطورون استجابات أقل قوة للأجسام المضادة (12) ، مما قد يؤدي إلى نتائج سلبية كاذبة إذا تم استخدام عتبات الفحص المقترحة لدينا. 

الأفراد الذين يعانون من عدوى خفيفة أو بدون أعراض قد يرتدوا بسرعة أكبر من الأفراد الذين يعانون من أعراض. 

تم العثور على تدرج الاستجابات حسب شدة المرض في حالات العدوى الأخرى ، بما في ذلك عدوى SARS-CoV-2 و MERS-CoV (19). 

اقترحت أيضًا وجود ارتباط بين شدة المرض وحركية استجابة الجسم المضاد من خلال اكتشافنا أن الأفراد المصابين بمرض أكثر حدة ، والذين يحتاجون إلى رعاية على مستوى وحدة العناية المركزة ،

 تحولوا مصليًا في وقت أبكر من الأفراد الذين لم يحتاجوا إلى دعم على مستوى وحدة العناية المركزة.

بينما تحدد الأجسام المضادة لـ RBD بدقة الأفراد المصابين بعدوى SARS-CoV-2 الحديثة ، لا يزال من غير المعروف ما إذا كانت هذه الاستجابات مرتبطة بالحماية من العدوى اللاحقة. 

في العديد من دراسات التحدي البشري لعدوى فيروس كورونا الباردة الشائعة ، ارتبط وجود الأجسام المضادة المعادلة بالحماية من العدوى المصحوبة بأعراض وتقليل إفراز الفيروس (5). 

بالإضافة إلى ذلك ، في قرود المكاك ريسوس الملقحة التي تم تحديها بعدوى SARS-CoV-2 ، كانت الأجسام المضادة المعادلة الموجهة إلى بروتين S أيضًا ارتباطًا قويًا بالمناعة الواقية وبالتالي ،

 فإن التتر المعادل ، في حالة عدم وجود علامات أخرى معروفة ، أصبح علامة مناعية فعلية للحماية في انتظار مزيد من التحقيق.

 في هذا السياق ، من الملاحظ أن الأجسام المضادة IgG المضادة لـ RBD كانت مرتبطة ارتباطًا وثيقًا بنفس الأجسام المضادة المعادلة التي ارتبطت بالحماية في قرود المكاك المحصنة (20).

 كان هذا الارتباط مع التتر المعادل أقوى مما لوحظ في الاختبارات المصلية التجارية الأخرى التي تم اختبارها سابقًا (21) ، واستمر كل من الأجسام المضادة المضادة لـ RBD والأجسام المضادة المعادلة على مدى 2.5 شهر من فترة المتابعة.

لذلك ، توفر نتائجنا دعمًا قويًا لتطبيق الأجسام المضادة لـ RBD كعلامة لعدوى SARS-CoV-2 الأخيرة بالإضافة إلى معلومات جديدة ومفصلة تتعلق بالخصوصية وحركية الاضمحلال للاستجابات المضادة لـ RBD. 

يفي نهج الاختبار المستخدم بإرشادات مركز السيطرة على الأمراض (CDC) للاختبار المصلي (22) ولديه القدرة على تسهيل التشخيص الدقيق في البيئات السريرية وتنفيذ الدراسات السكانية للعدوى السابقة على مستوى العالم. 

في حين أن الارتباط بين مضاد RBD-IgG والعيار المعادل واستمرار هذه الأجسام المضادة في النقاط الزمنية المتأخرة أمر مشجع ، إلا أن هناك حاجة إلى مزيد من العمل لتحديد الارتباطات المثلى بوساطة الجسم المضاد للمناعة الوقائية.

المواد والأساليب

تصميم الدراسة

قمنا بتقييم حجم وحركية استجابة الجسم المضاد البشرية المبكرة لمجال ربط مستقبلات بروتين السارس- CoV-2 ، بهدف إضافي هو تقييم خصوصية وحساسية استجابات الأجسام المضادة هذه لتحديد الأفراد المصابين بعدوى حديثة.

 وهكذا ، قمنا بقياس تركيز الأجسام المضادة في عينات الدم التي تم الحصول عليها من المرضى المؤكدين المصابين بعدوى SARS-CoV-2 المصحوبة بأعراض ومن الأفراد الضابطة الذين تم جمع عيناتهم قبل الوباء. 

تم قياس تركيزات الأجسام المضادة IgG و IgA و IgM بواسطة ELISA باستخدام المؤتلف SARS-CoV2 RBD في جميع العينات. 

في مجموعة فرعية من العينات ، تم أيضًا قياس استجابات الجسم المضاد المعادلة الموجهة ضد بروتين السنبلة باستخدام نموذج تحييد كاذب للفيروس البطيء. 

من هذه البيانات ، قمنا بنمذجة دقة التصنيف لكل نمط نظري فردي ومجموعات من الأنماط النظيرية في نقاط زمنية مختلفة ، والديناميات الزمنية للتحول المصلي والانقلاب المصلي بعد ظهور الأعراض.

جمع العينات

حصلنا على عينات من البلازما و / أو المصل ، تم جمعها للرعاية السريرية الروتينية ، من الأفراد المصابين بعدوى فيروس SARS-CoV-2 المؤكدة بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل ،

 والذين يعانون من الحمى و / أو أعراض الجهاز التنفسي الفيروسية من مارس إلى أبريل 2020 والذين استوفوا معايير RT-PCR اختبارات. 

تغيرت معايير اختبار SARS-CoV-2 بمرور الوقت ، ولكنها شملت في المقام الأول المرضى الذين يعانون من أعراض حادة تتطلب دخول المستشفى ، 

على الرغم من أن أولئك الذين لديهم عوامل خطر أخرى لتطور المرض (على سبيل المثال ، كان عمرهم 60 عامًا أو أكثر ،

 أو يعانون من مرض السكري ، أو يعانون من نقص المناعة) ، أو الذين عملوا أو عاشوا في بيئة فرضت فيها متطلبات مكافحة العدوى الحاجة إلى الاختبار. 

تضمنت عينات المصل / البلازما الإضافية التي تم جمعها من سبتمبر 2015 إلى ديسمبر 2019 قبل جائحة SARS-CoV-2 البالغين الأصحاء الذين تمت رؤيتهم في عيادة MGH للتحصين والسفر قبل السفر ، 

والمرضى الذين يخضعون للأمصال الروتينية ، والمرضى الذين يعانون من أمراض الحمى الأخرى المعروفة. تم تعطيل حرارة عينات البلازما ، باستثناء عينات الأمصال الروتينية ، 

عند 56 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة قبل التحليل.). 

تم استخلاص المعلومات الديموغرافية للمريض والنتائج المخبرية والنتائج السريرية من السجل الطبي الإلكتروني. 

تم اعتبار المرضى مثبطين للمناعة إذا كانوا يعانون من حالة مثبطة للمناعة (على سبيل المثال ، فيروس نقص المناعة البشرية مع عدد CD4 أقل من 200) أو كانوا على عامل مثبط للمناعة / مناعي في وقت قبولهم (على سبيل المثال ، ميثوتريكسات ، ريتوكسيماب) 

تمت الموافقة على جميع الأبحاث من قبل المراجعة المؤسسية المجلس لأبحاث الموضوعات البشرية في MGH.

بقع الدم الجافة (DBS)

اثنان وسبعون ميكرولترًا من متبرع واحد ، دم كامل سلبي مصلي تم جمعه من أنابيب هيبارين الصوديوم (Becton ، Dickinson ، NJ) ، 

تم زيادته بـ 8 ميكرولتر من البلازما المعطلة بالحرارة (10 ٪ من حجم الدم الكامل) للحفاظ على تكوين الدم الكامل النسبي. 

بافتراض أن البلازما تمثل 50٪ من حجم الدم الكلي ، فإن البلازما المسننة كانت 18.18٪ من حجم البلازما النهائي. 

تم رصد الدم الكامل (40 ميكرولتر) على بطاقات Whatman 903 Protein Saver (GE Healthcare ، Cardiff ، UK) في نسخ متماثل وسمح لها بالجفاف طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. 

تم وضع اثنين من اللكمات بحجم 6 مم 2 من بطاقة DBS (5 ميكرولتر من البلازما لكل لكمة) في 133 ميكرولتر PBS-0.05 ٪ توين 20 درجة الحموضة 7.4 (Sigma-Aldrich ، سانت لويس ، MO) 

وحضنت طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع التحريض اللطيف ثم تم استردادها بعد الطرد المركزي. 

تم افتراض أن التخفيف الكلي للبلازما المسننة في شطف DBS هو 1: 73.15 ، وهو ما يمثل التخفيف الأولي من الارتفاع (1: 5.5) والتخفيف الإضافي أثناء شطف DBS (1: 13.3)

مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA)

قامت مقايسات ELISA بقياس استجابات IgG و IgA و IgM لمجال ربط المستقبلات لبروتين السنبلة (RBD) من SARS-CoV-2 [GenBank: MN975262] ، 

فيروس متلازمة الشرق الأوسط التنفسية (MERS) [GenBank: AFY13307.1] ، SARS-CoV-1 [GenBank: AAP13441.1] ، 

وفيروسات كورونا الباردة الشائعة HKU1 [GenBank: AAT98580.1] ، OC229E [GenBank: AAK32191] ، OC43 [GenBank: AAT84362] ، و NL63 [GenBank: AKT07952]. 

تم استنساخ متواليات RBD في ناقل pVRC متبوعًا بالتعبير في خلايا الثدييات Expi293 (ThermoFisher Scientific ، Waltham ، MA) مع ببتيد ملزم للستربتافيدين C- طرف C- علامة His8X ، وتنقيته فوق راتنج TALON (Takara ، Mountain View ، CA)

 متبوعًا بالكروماتوغرافيا لاستبعاد الحجم وانشقاق علامته. 

تم تحديد كمية تركيزات الأجسام المضادة الخاصة بـ RBD (ميكروغرام / مل) باستخدام الأجسام المضادة أحادية النسيلة المضادة لـ RBD الخاصة بالنمط المتماثل. 

تم التعبير عن RBDs في خلايا تعليق Expi293F بعلامة SBP-His8X C- الطرفية ، وتم تنقيتها باستخدام كروماتوجرافيا التقارب ثم كروماتوجرافيا استبعاد الحجم قبل إزالة العلامة الخاصة به كما هو موضح سابقًا (23). 

باختصار ، تم تغليف 384 لوحًا جيدًا من Nunc MaxiSorp (Invitrogen ، Carlsbad ، CA) بإضافة 50 ميكرولتر من RBD في محلول كربونات (1 ميكروغرام / مل) واحتضانها لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة (RT)

تم بعد ذلك منع الصفائح لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة الغرفة مع 5٪ حليب خالي من الدسم في محلول ملحي مخزّن من تريس (TBS). 

تمت إضافة العينات المخففة (1: 100 في TBS مع 5٪ حليب ، 0.5٪ توين) إلى اللوحة (25 ميكرولتر / بئر) وحضنت لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية مع الرج. 

تم أيضًا تضمين التخفيفات التسلسلية 4 أضعاف إلى 1: 6400 للأفراد الذين يعانون من ارتفاع التتر. 

في نهاية فترة الحضانة ، تم غسل العينات 5 مرات باستخدام TBS عالي الملح 1X. 

في وقت لاحق ، تم إضافة الأجسام المضادة الثانوية المترافقة مع بيروكسيداز الفجل IgA و IgG و IgM للماعز (Jackson ImmunoResearch) 

عند 1: 10000 (IgG ، IgM) أو 1: 5000 (IgA) في 5٪ حليب في TBST إلى الأطباق ( 25 ميكرولتر / بئر) وحضنت في RT مع الرج لمدة 30 دقيقة تليها 5X 1X يغسل TBS عالية الملح وغسل أخير مع 1X TBS. 

تم اكتشاف ثانويات ملزمة باستخدام خطوة واحدة Ultra TMB (tetramethylbenzidine ؛ ThermoScientific ، Waltham ، MA ، 25 ميكرولتر / بئر). 

تم تحضين الألواح عند درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق في الظلام قبل إضافة 2 ن محلول توقف حامض الكبريتيك (25 ميكرولتر / بئر).

 تمت قراءة الكثافة الضوئية (OD) عند 450 نانومتر و 570 نانومتر على قارئ لوحة. 

تم تعديل قيم OD بطرح 570 نانومتر OD من 450 نانومتر OD. 

استخدمنا منحنى قياسيًا للنسخة المضادة لـ SARS-CoV-2 أحادية النسيلة ، CR3022 (24) ، لحساب تركيز مضاد RBD IgG و IgA و IgM معبرًا عنه بالميكروجرام / مل. 

ملاحظة: بالنسبة لمقارنات DBS والبلازما ، كان تركيز البداية 1: 200.

مقايسة تحييد الفيروس الكاذب

لتحديد نشاط تحييد SARS-CoV-2 لعينات البلازما الخاصة بنا ، استخدمنا نموذج تحييد كاذب للفيروس البطيء كما هو موصوف سابقًا (20) ، وهو ارتباط قوي بالمناعة الوقائية في قرود المكاك الريسوسي المتحدي (25).

 لقد عبرنا عن نتائج هذا الاختبار كعيار للجسم المضاد المطلوب لتحييد 50٪ من فيروس SARS-CoV-2 الزائف (NT50).

تحليل احصائي

عتبات النظائر الفردية

لقد اكتشفنا أولاً كيفية أداء عمليات قطع الأنماط الفردية (IgM و IgG و IgA) في تحديد الأفراد المصابين سابقًا. 

قارنا القياسات المأخوذة من ضوابط ما قبل الجائحة ، مع القياسات التي تم أخذها في أي وقت ، 7 أيام ، و8-14 يومًا ، و15-28 يومًا ، و> 28 يومًا بعد ظهور الأعراض. 

لقد قدرنا AUC لكل نمط متساوي ومجموعة الفترة الزمنية وحساب فترات الثقة 95٪. 

باستخدام حدود النمط المتماثل التي تم تحديدها بواسطة التركيز الأقصى (ميكروغرام / مل) الموجود بين المجموعة الكاملة من ضوابط ما قبل الجائحة (IgG: 0.57 ، IgM: 2.63 ، IgA: 2.02) ، قمنا بتقدير الحساسية وفواصل الثقة 95٪. 

قمنا أيضًا بتقييم كيفية تأثير تحديد القطع المحدد بواسطة التركيز الأقصى على الخصوصية من خلال التحقق المتقاطع بعشرة أضعاف.

الكفاءة من خلال التحقق المتقاطع من عشرة أضعاف.

نماذج تصنيف الغابات العشوائية

اكتشفنا كيفية الجمع بين الاستجابات المتعددة الخاصة بالنمط المتماثل مع نماذج تصنيف الغابات العشوائية ، 

والتي تسمح بالتفاعلات غير الخطية المعقدة بين الأنماط المتماثلة ، والتي يتم إجراؤها لتحديد الأفراد المصابين سابقًا.

 باستخدام إجراء التحقق من الصحة الموصوف سابقًا (26) ، قمنا بتخصيص كل من الحالات وعناصر التحكم في عشر مجموعات متساوية الحجم (أي الطيات) وحساب AUC مجمعة تم التحقق من صحتها (cvAUC).

 قمنا أيضًا بتقييم الأهمية المتغيرة داخل هذه النماذج المختلفة باستخدام مقياس قائم على اختبار التقليب ، يعني انخفاض الدقة. 

للتحقيق في تأثير عدم توازن الفئة (أي حقيقة أن لدينا العديد من الضوابط السلبية أكثر من الإيجابيات) على مقاييس أداء النموذج ، قمنا بالتحقيق في تأثير ضوابط الاختزال للحصول على نفس عدد الحالات على أداء النموذج.

تحليل زمن الانقلاب المصلي والانقلاب المصلي

لقد قصرنا تحليلنا على الأفراد الذين أجروا قياسًا واحدًا على الأقل لكل 28 يومًا من المتابعة (أي بين بداية ظهور الأعراض وآخر قياس لهم). 

بالنسبة للأفراد الذين يعانون من تقلبات حول القطع المحدد مسبقًا (N = 6) ، تم استخدام وقت الحدث الأول في التحليل. 

باستخدام البيانات الخاضعة للرقابة على المستوى الفردي ، قمنا بتركيب نماذج nonparametric (أي مقدر Turnbull) ونماذج وقت الفشل المتسارعة البارامترية باستخدام حزمة icenReg R (27).

 تم افتراض أن جميع بيانات الوقت إلى الحدث موزعة بسجل عادي. تم تقدير فترات الثقة بنسبة 95 ٪ من خلال أخذ عينات من الأفراد مع الاستبدال.

تم الانتهاء من جميع التحليلات باستخدام R (الإصدار 3.6.1) داخل Rstudio (الإصدار 1.2.5019).

الشكل S1: عدد الحالات الإيجابية لـ PCR مع عينة مأخوذة خلال كل أسبوع منذ ظهور الأعراض.

الشكل S2. قياسات متوسطة سلسة لـ IgG و IgM و IgA ضد مجال ربط مستقبلات البروتين المرتفع SARS-CoV-2 بين الحالات الإيجابية لـ PCR عبر الوقت.

الشكل S3. المسارات الفردية لـ 16 فردًا تم اختيارهم عشوائيًا باستخدام 4 قياسات أو أكثر.

الشكل S4. قياسات IgG و IgM و IgA ضد مجال ارتباط مستقبلات البروتين السارس-CoV-2 بين الضوابط السابقة للوباء والحالات الإيجابية لـ PCR.

الشكل S5. منحنى خاصية تشغيل جهاز الاستقبال من نماذج الغابات العشوائية ومساهمات النظائر.

الشكل S6. مصفوفات الارتباك وتقديرات الخطأ خارج الحقيبة لنماذج الغابات العشوائية.

الشكل S7. مصفوفات الارتباك وتقديرات الخطأ خارج الحقيبة لنماذج الغابات العشوائية مع ضوابط مختزلة.

الشكل S8. قياسات IgG و IgA و IgM ضد RBD لفيروسات كورونا الأخرى بين الضوابط السابقة للوباء والحالات الإيجابية لـ PCR.

الشكل S9. العلاقة بين البلازما وقياسات بقعة الدم المجففة (DBS).

الجدول S1. تسلسلات الأحماض الأمينية الكاملة لمجالات ربط مستقبلات الفيروس التاجي (RBDs) المستخدمة في هذه الدراسة.

الجدول S2. الدقة التنبؤية لنماذج متعددة من أجل تصنيف عناصر التحكم والحالات بمرور الوقت منذ ظهور الأعراض.

الجدول S3. التقديرات البارامترية لمتوسط ​​الوقت للانقلاب المصلي لكل نمط نظري حسب خصائص المريض المختلفة.

الجدول S4. ملف البيانات الخام (جدول بيانات Excel)