فوائد حمض D- الأسبارتيك للرجال

 

 آلية وتثبيط غراء مثل البروتياز ، PLpro ، من SARS ‐ CoV ‐ 2

 يقوم فيروس كورونا SARS ‐ CoV ‐ 2 بتشفير مجال بروتياز أساسي يشبه غراء كجزء من البروتين غير الهيكلي (nsp) ‐3 ، وهو SARS2 PLpro ، الذي يشق 

البروتينات المتعددة الفيروسية ، ولكنه يزيل أيضًا ubiquitin ‐ مثل تعديلات البروتين ISG15 مثل ، مع نشاط أقل ، بوليوبيكويتين مرتبط بـ Lys48. تكشف هياكل PLpro المرتبطة بـ ubiquitin و ISG15 أن موقع ربط S1 ubiquitin ‐ مسؤول عن نشاط 

ISG15 العالي ، بينما يوفر موقع الربط S2 خصوصية سلسلة Lys48 وكفاءة الانقسام. لتحديد مثبطات PLpro في نهج إعادة تحديد الغرض ، فإن فحص 3727 من الأدوية والمركبات السريرية المعتمدة الفريدة ضد SARS2 PLpro لم يحدد أي مركبات تمنع PLpro باستمرار أو يمكن التحقق من صحتها في الشاشات المضادة. والأمر الواعد هو أن مثبطات السارس PLpro ذات الجزيء الصغير غير التساهمية تستهدف أيضًا SARS2 PLpro ، وتمنع المعالجة الذاتية لـ nsp3 في الخلايا وتعرض فعالية عالية ونشاطًا ممتازًا مضادًا للفيروسات في نموذج عدوى SARS CoV ‐ 2.

تشرح الهياكل البلورية خصوصية السارس - CoV - 2 غراء شبيه بالبروتياز ، PLpro ، للديوبيكويتين المرتبط بـ ISG15 و Lys48 ، والتثبيط النوعي لـ PLpro بواسطة الجزيئات الصغيرة ، يظهر تأثيرات قوية مضادة للفيروسات.

SARS ‐ CoV-2 PLpro يشق بشكل تفضيلي ISG15 ويستهدف أيضًا سلاسل Lys48 ubiquitin الأطول المرتبطة.

يتم توفير تفضيل ISG15 بواسطة موقع ربط S1 ubiquitin في PLpro ، بينما يتم توفير خصوصية Lys48 ‐ polyubiquitin بواسطة موقع ربط S2 ubiquitin.

في شاشة عالية الإنتاجية ، لا تستطيع الأدوية المعتمدة من إدارة الغذاء والدواء والمركبات السريرية في المراحل المتأخرة تثبيط PLpro في المختبر.

تستهدف مثبطات SARS PLpro المعروفة أيضًا SARS2 PLpro وتظهر فعالية مضادة للفيروسات.

المقدمة

جائحة COVID-19 التي تتكشف على مستوى العالم في النصف الأول من عام 2020 () ناتجة عن فيروس كورونا الجديد SARS ‐ CoV ‐ 2 (مجموعة دراسة Coronaviridae التابعة للجنة الدولية لتصنيف الفيروسات ، 2020) وأبرزت ، من بين أشياء كثيرة ، النقص العام في الأدوية الجزيئية الصغيرة المضادة للفيروسات لمكافحة جائحة فيروس كورونا العالمي.

 تعد الإنزيمات المحللة للبروتين ضرورية لفيروسات كورونا التي تعبر عن آلية البروتين الخاصة بها كبروتين متعدد البروتين يتطلب الانقسام إلى وحدات وظيفية ). نتيجة لذلك ، تفقد فيروسات كورونا ذات نشاط البروتياز المحظور قدرتها على التكاثر في الخلايا (Kim et al ، 1995). ولذلك فإن تعاطي البروتياز في السارس ‐ CoV 2 هو محور تركيز حالي للجهود الأكاديمية العالمية المتضافرة والدوائية

يشفر SARS ‐ CoV ‐ 2 بروتياز ، البروتياز الشبيه بالغراء (PLpro ، المشفر داخل nsp3) و 3 chymotrypsin مثل البروتياز "الرئيسي" (3CLpro أو Mpro ، المشفر بواسطة nsp5). يشق PLpro nsp1 و nsp2 و nsp3 (الشكل 1A) و 3CLpro بمعالجة البروتينات غير الهيكلية الـ 13 المتبقية. بعد جيلهم ، يقوم nsps بتجميع مجمع النسخ المتماثل الفيروسي على أغشية المضيف ، ويبدأ في تكرار ونسخ الجينوم الفيروسي (

كارتون أنشطة فيروس كورونا PLpro. تم ترميز PLpro كواحد من المجالات المختلفة للبروتين غير الهيكلي للحمض الأميني 1900 nsp3 ويعتقد أن له ثلاث وظائف: 

(1) شق البروتين المتعدد الفيروسي لتوليد nsp1 الناضج و nsp2 و nsp3 ؛ 

(2) التحلل المائي لسلاسل يوبيكويتين المهمة للاستجابات الالتهابية و 

(3) إزالة تعديلات الجين 15 (ISG15) المحفّز للإنترفيرون من البروتينات ، وعكس الاستجابات المضادة للفيروسات.

ب.

رسم تخطيطي لمواقع ربط ubiquitin في SARS PLpro ، والتي تربط Lys48 triubiquitin عبر مواقع الربط S2 و S1 و S1 ubiquitin. يحدث التحلل المائي بين جزيئات يوبيكويتين المرتبطة في S1 و S1 ′.

ج.

تحليل الدورة الزمنية للتحلل المائي تريوبيكويتين (2 ميكرومتر) باستخدام 250 نانومتر SARS2 PLpro ، حلها على هلام SDS – PAGE الملون Coomassie. الانقسام الخاص بالارتباط بين ثلاثي يوبيكويتين المرتبط بـ Lys48 إلى di‐ و monoubiquitin يشبه نشاط SARS PLpro (Békés et al، 2015، 2016). انظر الملحق الشكل S1B-D لتقدير الانقسام على أساس هلام.

د.

نظرة عامة على الكفاءات التحفيزية لـ PLpro. تم استخدام مقايسة الاستقطاب الفلوري (FP) لاشتقاق الكفاءات التحفيزية (kcat / KM) لـ PLpro للركائز المصورة. 

تم حساب الكفاءات التحفيزية من البيانات الموضحة في الملحق الشكل S1A ، كما هو موضح في المواد والطرق. 

يُشار إلى تفضيل الركيزة بواسطة نشاط x ‐ fold بالنسبة إلى انشقاق Ub-TAMRA.

E.

بنية بلورية بدقة 2.7 Å من SARS2 PLpro مع نطاقات فرعية ملونة بظلال زرقاء ، مرتبطة بـ ubiquitin propargylamine (Ub PA ، برتقالي). 

تظهر بقايا الثالوث التحفيزي في تمثيل الكرة والعصا ، ويشار إلى أيون الزنك على أنه كرة رمادية.

.

F.

بنية بلورية بدقة 2.9 Å من SARS2 PLpro (أزرق) مرتبطة بـ ISG15 C المجال الطرفي propargylamide (ISGCTD D PA ، السلمون). 

 

يمكن أن يكون للبروتياز الفيروسي وظائف إضافية ويمكنه ، على سبيل المثال ، أن يعمل على تثبيط الاستجابات المناعية الفطرية للمضيف التي يتم تثبيتها في البداية كاستجابة التهابية ، وبالتالي كاستجابة للإنترفيرون.

 يولد نظام الإنترفيرون حالة مضادة للفيروسات في الخلايا المضيفة من خلال تنظيم النسخ لأكثر من 300 جينة محفزة للإنترفيرون (ISGs) ، للكشف الفعال عن التهديدات الفيروسية والاستجابة لها 

 الاستجابات الالتهابية غير المنتظمة هي السمة المميزة لـ COVID-19 ، وترتبط معدلات الاعتلال والوفيات الجوهرية باستجابات مناعية مفرطة الحماس ("عاصفة خلوية") ، مما يتسبب في أضرار جانبية

الآلية الشائعة التي ينظم بها البروتياز الفيروسي المسارات المناعية الفطرية هي من خلال معاداة يوبيكويتين وتعديلات مثل يوبيكويتين

. يعد انتشار البروتين أمرًا معقدًا نظرًا لحدوث العديد من أبنية سلسلة يوبيكويتين التي تشفر وظائف غير متحللة وتدهورية

 تعتمد مسارات الإشارات الالتهابية على إشارات يوبيكويتين متميزة يتم تنظيمها بواسطة آليات معقدة في الخلايا البشرية (

 ISG15 هو تعديل يشبه اليوبيكويتين (Ubl) الناجم عن العدوى الفيروسية ويتكون من طيتين Ubl مدمجتين ، تشبه هيكليًا الديوبيكويتين

 فقط عدد قليل من الإنزيمات الخلوية يزيل ISG15 ، مما يتيح لهذا التعديل أن يعمل كإشارة خطر يسببها الفيروس.

 استجابةً لذلك ، غالبًا ما تقوم الفيروسات بإعادة توظيف البروتياز الخاص بها ليكون  فعالين. 

تم اعتماد العديد من سقالات البروتياز الرائدة لاستهداف معدلات يوبيكويتين و Ubl ، بما في ذلك مجالات ورم المبيض (OTU) في بونيافيريداي 

 والبروتياز الشبيه بالباباين في بعض Picornaviridae).

الأهم من ذلك ، أن إنزيمات PLpro الفيروسية تزيل بكفاءة تعديلات ISG15 و ubiquitin ، مما يخفف الالتهاب والإشارات المضادة للفيروسات

 قامت مجموعة كبيرة من العمل من قبل Mesecar و Pegan و Kikkert / Mark وغيرها من المختبرات بإلقاء الضوء على آليات SARS و MERS PLpro بتفصيل كبير ، وكشف عن آليات ربط يوبيكويتين و ISG15 ، وتحديد مثبطات الجزيئات الصغيرة لـ SARS PLpro.

حدد s وآخرون (2015 ، 2016) أيضًا ميزة مثيرة للاهتمام لنشاط إزالة التكاثر في SARS PLpro. تتعرف معظم DUBs على ubiquitin واحد ، عبر موقع ربط إنزيمي S1 ubiquitin ، وتكون قادرة على ربط البوليوبيكويتين وشقه على وجه التحديد من خلال الارتباط بـ diubiquitin عبر الموقع النشط (أي إلى مواقع الربط S1 و S1 S ubiquitin ،) .

 في المقابل ، يتعرف SARS PLpro على البوليوبيكويتين المرتبط بـ Lys48 عبر مواقع الربط S1 و S2 ubiquitin ، وبالتالي فهو قادر على إزالة الديوبيكويتين المرتبط بـ Lys48 من الركائز 

نحن هنا نوسع الدراسات لتشمل SARS2 PLpro ونوفر بيانات حركية وخصوصية تكشف عن تفضيل SARS2 PLpro لـ ISG15 على سلاسل بوليوبيكويتين المرتبطة بـ Lys48 في المختبر.

 نحن نربط خصوصية المُعدِّل بموقع ربط S1 ubiquitin ، الموضح في تركيبتين بلوريتين من مجمعات PLpro والطفرات. 

موقع ربط S2 في SARS2 PLpro له تأثير ضئيل على التحلل المائي ISG15 ، ولكنه بدلاً من ذلك يعيد نشاط وخصوصية سلسلة Lys48.

 أخيرًا ، نقدم رؤى حول تثبيط PLpro. 

لا تكشف شاشة إعادة الاستخدام مع المركبات السريرية المعتمدة من إدارة الأغذية والعقاقير (FDA) عن أي أدوية مرشحة تمنع PLpro في المختبر. 

في المقابل ، تُظهر مثبطات SARS PLpro المطورة سابقًا تثبيطًا ممتازًا وفعالية مضادة للفيروسات ، مما يثبط المعالجة الذاتية لـ nsp3 وكذلك انقسام Lys48 ‐ polyubiquitin في الخلايا ، والتكاثر الفيروسي في نموذج عدوى SARS ‐ CoV ‐ 2.

لنتائج

التوصيف الكيميائي الحيوي لنشاط SARS2 PLpro

SARS2 PLpro مطابق بنسبة 83٪ لـ SARS PLpro 

 ومن المتوقع أن يستهدف ubiquitin و ISG15. 

بدءًا من يوبيكويتين ، لوحظ نشاط قوي لـ SARS2 PLpro وخصوصية عالية تجاه البوليوبيكويتين المرتبط بـ Lys48 (الشكل 1C) ، حيث تم شق تريوبيكويتين إلى منتجات ديو ومونوبيكويتين مستقرة كما لوحظ سابقًا بالنسبة لـ SARS PLpro  

للحصول على رؤى حركية ، قمنا بقياس الكفاءة التحفيزية PLpro (kcat / KM) في اختبار كمي قائم على الاستقطاب الفلوري ، حيث يرتبط ببتيد Lys ‐ Gly ‐ TAMRA (KG ‐ TAMRA) بـ ubiquitin عبر سلسلة جانبية Lys من خلال رابطة isopeptide ، تشبه بشكل أفضل الركيزة الطبيعية

 تحلل مائيًا ركيزة ubiquitin TAMRA بكفاءة منخفضة (86 M − 1 s 1). تم تحلل الببتيد KG-TAMRA نفسه بمعدل 19 ضعفًا أسرع (1634 M − 1 s − 1) عند ربطه بـ Lys48 diubiquitin غير القابل للكسر (الشكل 1D ، الملحق الشكل S1A) ، بما يتوافق مع SARS2 PLpro الذي يفضل سلاسل أطول (الشكل 1C) ). 

يشير هذا إلى مساهمة كبيرة لطول السلسلة في نشاط PLpro ، كما لوحظ في SARS PLpro ).

اللافت للنظر ، تم تحلل الركيزة الفلورية ISG15 TAMRA بشكل مائي 350 ‐ أضعاف بكفاءة أكبر مقارنة بـ ubiquitin ‐ TAMRA ، والركيزة التي تضم فقط C الطرفية ubiquitin مثل أضعاف ISG15 (ISG15CTD ‐ TAMRA) لا يزال مشقوقًا بكفاءة أعلى بمقدار 160 ضعفًا مقارنةً باليوبيكويتين 

 ومن ثم يتم التوسط في ISG15 مقابل تفضيل ubiquitin من خلال التعرف على طية Ubl واحدة ، والتي من شأنها أن ترتبط بموقع الربط S1 ubiquitin / Ubl لـ PLpro.

 تم الحصول على نتائج مماثلة باستخدام التحليل القائم على الهلام لـ Lys48 triubiquitin مقابل انقسام proISG15 لتنضج ISG15 ؛ في الأخير ، تتم إزالة ببتيد 8 بقايا من المحطة ISG15 أو ISG15CTD C ). اقترح هذا التقييم النوعي للنشاط أنشطة مماثلة لـ PLpro تجاه أي من الركائز 

لتحليل الهيكلي لمجمعات SARS2 PLpro ubiquitin و ISG15

أشار الانقسام التفاضلي لركائز اليوبيكويتين و ISG15CTD (الشكل 1D) إلى أن موقع ربط S1 ubiquitin / Ubl لـ PLpro يتفاعل مع كلا المعدلين بشكل واضح. SARS2 PLpro الهياكل البلورية المرتبطة تساهميًا بـ ubiquitin propargylamide (Ub PA) عند 2.7 Å و ISG15CTD ‐ PA بدقة 2.9 ، تمكن من المقارنة المباشرة 

 بالتوافق مع الهياكل السابقة لـ SARS و MERS PLpro (الشكل EV2) ، وتشبه من الناحية المفاهيمية إنزيمات البروتياز (USP) البشرية الخاصة باليوبيكويتين 

، تربط PLpro اليوبيكويتين في بنية "اليد المفتوحة" ، حيث يوبيكويتين يقع على النطاق الفرعي "النخلة" ويتم تثبيته في مكانه بواسطة المجال الفرعي "أصابع" الملزمة بالزنك ، بحيث تصل نهاية يوبيكويتين C ، موقع التحلل المائي ، إلى المركز التحفيزي

. يشبه هيكل SARS2 PLpro ، وموضع واتجاه جزيء يوبيكويتين المرتبط ، إلى حد كبير SARS PLpro ~ Ub (pdb 4m0w ،  ؛ ، RMSD 0.54 Å لـ PLpro ،

يقع le ISG15CTD بالمثل على المجال الفرعي "Palm" ، وهو يتفاعل مع "Thumb" بدلاً من المجال الفرعي "Fingers" لـ SARS2 PLpro (الشكلان 2A و EV3A). 

يؤدي الدوران الناتج بمقدار 40 درجة تقريبًا من اللولب Ubl ‐ fold ل مقارنةً باليوبيكويتين إلى تحولات تصل إلى 15 للمخلفات المتطابقة هيكليًا في Ubl ‐ fold (الأشكال 2A و EV3A و B).

 تتمركز مواقع التفاعل الرئيسية التي تتوسط جهات اتصال ISG15CTD ‐ PLpro حول ISG15 Trp123 و Pro130 / Glu132 ، حيث يتم إرساء ISG15 على اللولب PLpro ل7 (الشكل EV3C). 

هذه التفاعلات تزيح Ubl fold من المجال الفرعي Fingers (الشكل 2 أ). 

بينما يشبه المجمع أوضاع التفاعل التي لوحظت في SARS PLpro ~ ISG15CTD (pdb 5tl7  ، RMSD 0.74 Å لـ PLpro ، انظر الشكل EV2) ،

 لا يتم حفظ بعض المخلفات المتفاعلة (خاصة ، Tyr171 على الحلزون ل7) ( الشكلان EV1 و EV3C) ويبدو أنهما يحسنان الاتصال في SARS2 PLpro. 

لوحظ المزيد من التباين في MERS PLpro ، والذي يرتبط بـ ubiquitin و ISG15CTD بالمثل من خلال قدرته على "إغلاق" المجال الفرعي Fingers 

الكفاءات الأنزيمية المحسوبة لانقسام K48 ‐ diUb-TAMRA ، متبوعًا باستقطاب مضان مع النوع البري PLpro  ، و PLpro F69S.

 باستخدام نفس نطاق التركيز لـ SARS2 PLpro ، لا يمكن تركيب نشاط متحولة F69S ؛ (وسط) استعاد تركيز أعلى نشاطًا أقل قليلاً مقارنة بـ PLpro cleaving ubiquitin TAMRA (45 مقابل 86 M − 1 s − 1 ،

 كفاءة أقل بمقدار ˜ 3 أضعاف لـ PLpro F69S cleaving ISG15 TAMRA تنتج قيمًا مشابهة لانقسام ISG15CTD ‐ TAMRA 

 ، مما يشير إلى أن موقع S2 يساهم في الاختلاف في الربط لـ N ‐ terminal Ubl ‐ fold . 

أجريت تجارب لـ F69S في نسخ تقنية ثلاثية ونسخة بيولوجية ؛ يتم استنساخ البيانات من النوع البري من التجارب الموضحة في الشكل 1 د ، الملحق الشكل S1A.

D – F.

يُظهر التحليل المستند إلى الهلام الدورة الزمنية للتحلل المائي لتريوبيكويتين (D) و proISG15CTD (E) و proISG15 (F) باستخدام النوع البري PLpro (المواد الهلامية من النوع البري الأيسر المستنسخة من الملحق الشكل S1B-D لتمكين المقارنة المباشرة) أو PLpro F69S (حق). 

PLpro F69S له تأثير قوي على التحلل المائي تريوبيكويتين (D) ، ولا يوجد تأثير ملحوظ على التحلل المائي لـ proISG15CTD (E) ويقلل انقسام proISG15 إلى نفس مستويات proISG15CTD (قارن E ، F) ، أجريت التجارب في نسختين.

 

باستمرار ، لم يعد PLpro F69S يتحلل بالماء K48 ‐ diUb ‐ TAMRA (الشكل 3C) ، أو بالأحرى ، يقلل الكفاءة إلى المستويات التي لوحظت مع Ub-TAMRA 

 في المقابل ، قلل PLpro F69S من التحلل المائي ISG15 TAMRA ~ 3 أضعاف ، أي إلى المستويات التي لوحظت لانقسام PLpro البري من ISG15CTD 

 يمكن استخلاص نفس الاستنتاجات من التحليل القائم على الهلام 

 قام SARS2 PLpro F69S بتقليل انقسام Lys48 triubiquitin بشكل كبير ، دون التأثير على انشقاق proISG15CTD ، مع تأثير بسيط على انقسام proISG15 

 ومع ذلك ، فإن التأثيرات من 2 إلى 3 أضعاف لطفرات موقع S2 على ISG15 (الشكل 3C و F) ضآلة مقارنةً بالتأثيرات القوية لطفرات موقع S2 على انشقاق Lys48 ‐ poly ubiquitin (الشكل 3C و D) ، و S1 طفرات الموقع على انشقاق ISG15 (الشكلان 2 و EV3F).

 مجتمعة ، توفر بياناتنا التفاصيل الجزيئية لكيفية استهداف SARS2 PLpro لليوبيكويتين و ISG15 ، والتي تشبه من الناحية المفاهيمية الأنشطة الموصوفة سابقًا لـ SARS PLpro

إعادة استخدام الأدوية المعروفة لتثبيط نشاط PLpro

بعد ذلك ، ركزنا انتباهنا على المسألة العاجلة المتمثلة في تثبيط PLpro ، لتأكيد قابليتها للدواء ولتوفير مرشحين جدد للأدوية بفعالية في علاج COVID-19. 

من الناحية المثالية ، يُظهر الدواء المعتمد سريريًا بالفعل تأثيرًا دوائيًا مناسبًا على PLpro مع إمكانية تثبيط أقل من ميكرومتر ، واختراق الخلايا ، والتوافر الحيوي عن طريق الفم ، وملامح أمان واسعة النطاق للجرعة المطلوبة. 

يمكن تسريع مثل هذا الدواء للتجارب السريرية.

تم تكييف مقايسة إنتاجية عالية بحجم 1،536 36 منخفضة الحجم تم استخدامها سابقًا لتحديد مثبطات deubiquitinases البشرية 

 من أجل SARS2 PLpro 

 كعنصر تحكم في التثبيط الكامل ، تم استخدام الإصدار Racemic من مركب الأدب 5c 

(المشار إليه هنا باسم rac5c ، انظر أدناه) بتركيز 10 ميكرومتر وتم تثبيط PLpro بالكامل (الشكل EV4D ، برتقالي) . 

تم فحص مكتبة منسقة من 5،576 مركبًا ، تضم 3727 دواءً فريدًا معتمدًا ومرشحًا للأدوية السريرية للمرحلة المتأخرة (الملحق S1 ، جميع المركبات المدرجة في Dataset EV1) ، في ثلاث نسخ بتركيز دوائي 4.2 ميكرومتر (الشكلان 4A و EV4D-F ، مجموعة البيانات EV1).

تم إجراء فحص عالي الإنتاجية لـ SARS2 PLpro مقابل 5،576 دواءً معتمدًا ومركبات إكلينيكية في المرحلة المتأخرة ، في شكل بئر 1،536 باستخدام Ub-Rhodamine

 يتم عرض نسختين من أصل ثلاثة ؛ كانت المركبات المصابة هي تلك التي تثبط نشاط PLpro بأكثر من 40٪ في جميع التكرارات الثلاثة. تجاوز الارتباط (R2) بين جميع الشاشات 0.89. انظر الشكل EV4 لتصميم المقايسة ومراقبة الجودة والمواد والطرق.

ب.

تم تقييم مركبات الضرب والمركب rac5c بشكل إضافي في معايرة IC50 بمقدار 10 نقاط باستخدام مقايسة Ub Rhodamine ، باستخدام تركيز بدء قدره 100 ميكرومتر مخفف تسلسليًا في خطوات 1: 3. 

تظهر درجة التثبيط كخريطة معايرة للحرارة من الظلام (التثبيط الكامل) إلى اللون الأزرق الفاتح (منخفض / لا يوجد تثبيط).

 تم استخدام المجال التحفيزي لـ USP21 البشري  كشاشة عدادات. 

أظهر كل مركب ضرب PLpro إما عدم وجود نشاط في تحليل المعايرة أو ملف تعريف تثبيط متطابق ضد PLpro و USP21 ، مما يشير إلى تداخل الفحص.

 كان Rac5c خاصًا بـ SARS2 PLpro ولم يثبط USP21 حتى عند أعلى تركيز قدره 100 ميكرومتر. 

تم إجراء فحوصات IC50 في ثلاث نسخ تقنية في تجربتين مستقلتين.

أظهرت مجموعة من 15 مركبًا 40-90٪ من تثبيط PLpro في كل شوط ثلاثي 

 تم استبعاد سبعة من هذه الإيجابيات الخاطئة الشائعة (المركبات أو الأصباغ التفاعلية التي تتداخل مع المقايسات).

 تم اختبار المركبات الثمانية المتبقية في تجارب معايرة بمقدار 10 نقاط لقياسات IC ، بالإضافة إلى فحصها مقابل المجال التحفيزي لـ USP البشري

 لقد اخترنا هذا البروتين البشري لتقييم الانتقائية المحتملة لتثبيط PLpro على DUB البشري التمثيلي وكشاشة مضادة. 

يختلف PLpro و USP21 بشكل كافٍ لاستنتاج أن أي مركبات تثبط كلاهما باستخدام IC مماثل من المحتمل أن تكون إيجابيات خاطئة تتداخل مع الفحص. 

بعد المعايرة الكاملة ضد PLpro و USP21 ، وجدنا أن النتائج الثمانية كانت إما غير نشطة في التحقق من الصحة ، أو نشطة بشكل متساوٍ تجاه PLpro و USP21 (الشكل 4B) ، مما يشير إلى أن أيًا من النتائج المحددة لم تكن مثبطات PLpro حقيقية. يتناقض هذا مع rac5c ، الذي منع PLpro ، لكنه لم يمنع USP21 حتى عند تركيز 100 ميكرومتر (الشكل 4 ب).

تشير بياناتنا معًا إلى أنه من غير المرجح أن تؤدي استراتيجية إعادة الاستخدام التي تستخدم 3727 دواءً معروفًا فريدًا نحو SARS2 PLpro إلى ظهور مرشحين للأدوية وتسلط الضوء على أهمية شاشة مضادة في تقييم صحة النتائج القادمة من شاشة الأدوية المعروفة قبل أي استنتاجات حول إمكاناتها العلاجية يمكن رسمه. ستكون فحوصات الشاشة القوية والمقايسات المتعامدة لـ PLpro مفيدة في حملات اكتشاف الأدوية.

استغلال مثبطات SARS PLpro المعروفة ضد SARS2 PLpro

كان SARS PLpro محور جهود اكتشاف الأدوية الأكاديمية في العقدين الماضيين 

سلسلة أولية من الجزيئات الصغيرة غير التساهمية تم تنقيحها لاحقًا لتحقيق مثبطات ميكرومتر دون سارس PLpro بخصوصية عالية وسمية خلوية منخفضة 

 تم تطوير العقاقير بمساعدة التحليل الهيكلي للعديد من مجمعات مركبات SARS PLpro (الشكلان 5A و EV5A و B) ، مما يدل على أن المركبات ترتبط في القناة التي يشغلها ذيل ubiquitin / ISG15 C ، المحصور بين مجال الإبهام SARS PLpro و أ ما يسمى Blocking Loop (BL) ، الذي يحتوي على بقايا Tyr حرجة (Tyr269 في SARS ، Tyr268 في SARS2 

إن امتداد Tyr ، الذي يفتقر إلى BL في MERS PLpro (الشكل EV1) ، يجعله غير عرضة لبعض مثبطات السارس 

 الأهم من ذلك ، أن تسلسل وطول BL ، وجميع المخلفات المتضمنة في تفاعلات المثبط ، متطابقة بين SARS و SARS2 PLpro (الأشكال 5A و EV1 و EV5A و B) ، مما يشير إلى أن مثبطات SARS PLpro قد يكون لها إمكانات مثبطة ضد SARS2 PLpro.

 تستهدف مثبطات سارس PLpro SARS2 PLpro

أ.

هيكل SARS PLpro مرتبط بالمركب 3j (سماوي / أصفر ، pdb 4ovz (Baez ‐ متراكب مع SARS2 PLpro˜Ub (أزرق / برتقالي). 

يظهر الشكل الداخلي المركب 3j المرتبط بالقرب من الموقع النشط. انظر الشكل EV5A و B لمزيد من التفاصيل.

ب.

التركيب الكيميائي لـ rac5c. انظر الطرق التكميلية الملحق للحصول على التفاصيل حول التوليف المركب والتوصيف.

ج.

تثبيط في المختبر (IC50) لمثبطات SARS2 PLpro. أجريت التجارب باستخدام اختبار HTS (الشكل 4) ، في ثلاث نسخ تقنية في ثلاث تجارب مستقلة. تم استخدام متوسط ​​هندسي لتحديد IC.

د.

تم التعبير عن nsp3 كامل الطول من ناقل C - GFP - الموسوم في خلايا HEK293T وعولج بتركيزات متزايدة من rac5c لمدة 24 ساعة. يتم تحرير GFP من الطرف C ، ويفترض أن يكون عن طريق نشاط الأنزيم البروتيني nsp3. 

يمكن اكتشاف Nsp3 بواسطة جسم مضاد لـ SARS / SARS2 PLpro (انظر الشكل EV5E للتحقق من صحة الجسم المضاد). 

تم مسح Lysates من أجل بوليوبيكويتين مرتبط بـ Lys48 مع جسم مضاد خاص بالربط (K48). تم إجراء التجارب في نسختين مع نتائج مماثلة

تم إجراء فحص عالي الإنتاجية لـ SARS2 PLpro مقابل 5،576 دواءً معتمدًا ومركبات إكلينيكية في المرحلة المتأخرة ، بتنسيق بئر 1،536 باستخدام Ub Rhodamine 

يتم عرض مكررين من أصل ثلاثة ؛ كانت المركبات المصابة هي تلك التي تثبط نشاط PLpro بأكثر من 40 ٪ في جميع التكرارات الثلاثة. تجاوز الارتباط (R2) بين جميع الشاشات 0.89. انظر الشكل EV4 لتصميم المقايسة ومراقبة الجودة والمواد والطرق.

ب.

تم تقييم مركبات الضرب والمركب rac5c  بشكل أكبر في معايرة IC50 بمقدار 10 نقاط باستخدام مقايسة Ub Rhodamine ، باستخدام تركيز بدء قدره 100 ميكرومتر مخفف بشكل متسلسل في خطوات 1: 3.

 تظهر درجة التثبيط كخريطة معايرة للحرارة من الظلام (التثبيط الكامل) إلى اللون الأزرق الفاتح (منخفض / لا يوجد تثبيط).

 تم استخدام المجال التحفيزي لـ USP21 البشري كشاشة عدادات. لم يُظهر كل مركب ضرب PLpro أي نشاط في تحليل المعايرة أو ملف تعريف تثبيط مماثل ضد PLpro و USP21 ، مما يشير إلى تداخل الفحص.

 كان Rac5c خاصًا بـ SARS2 PLpro ولم يمنع USP21 حتى عند أعلى تركيز قدره 100 ميكرومتر. تم إجراء فحوصات IC50 في ثلاث نسخ تقنية في تجربتين مستقلتين.

أظهرت مجموعة من 15 مركبًا 40-90٪ من تثبيط PLpro في كل شوط ثلاثي (الشكل 4 أ).

 تم استبعاد سبعة من هذه الإيجابيات الزائفة التي لوحظت بشكل شائع (مركبات تفاعلية أو أصباغ تتداخل مع المقايسات). 

تم اختبار المركبات الثمانية المتبقية في تجارب معايرة بمقدار 10 نقاط لقياسات IC50 ، بالإضافة إلى فحصها مقابل المجال التحفيزي لـ USP21 البشري 

لقد اخترنا هذا البروتين البشري لتقييم الانتقائية المحتملة لتثبيط PLpro على DUB البشري التمثيلي وكشاشة مضادة. 

يختلف PLpro و USP21 بشكل كافٍ لاستنتاج أن أي مركبات تثبط كلاهما باستخدام IC مماثل من المحتمل أن تكون إيجابيات خاطئة تتداخل مع الفحص. 

بعد المعايرة الكاملة ضد PLpro و USP21 ، وجدنا أن النتائج الثمانية كانت إما غير نشطة في التحقق من الصحة ، أو نشطة بشكل متساوٍ تجاه PLpro و USP21 (الشكل 4B) ، مما يشير إلى أن أيًا من النتائج المحددة لم تكن مثبطات PLpro حقيقية. 

يتناقض هذا مع rac5c ، الذي منع PLpro ، لكنه لم يمنع USP21 حتى عند تركيز 100 ميكرومتر (الشكل 4 ب).

معًا ، تشير بياناتنا إلى أنه من غير المرجح أن تؤدي استراتيجية إعادة الاستخدام التي تستخدم 3727 دواءً معروفًا فريدًا نحو SARS2 PLpro إلى إعطاء مرشحين للأدوية وتسلط الضوء على أهمية شاشة مضادة في تقييم صحة النتائج القادمة من شاشة الأدوية المعروفة قبل أي استنتاجات حول إمكاناتها العلاجية يمكن رسمه. 

ستكون فحوصات الشاشة القوية والمقايسات المتعامدة لـ PLpro مفيدة في حملات اكتشاف الأدوية.

استغلال مثبطات SARS PLpro المعروفة ضد SARS2 PLpro

كان SARS PLpro محور جهود اكتشاف الأدوية الأكاديمية في العقدين الماضيين  

سلسلة أولية من الجزيئات الصغيرة غير التساهمية تم تنقيحها لاحقًا لتحقيق مثبطات ميكرومتر دون سارس PLpro بخصوصية عالية وسمية خلوية منخفضة 

 تم تطوير العقاقير بمساعدة التحليل الهيكلي للعديد من مجمعات مركبات SARS PLpro (الشكلان 5A و EV5A و B) ، مما يدل على أن المركبات ترتبط في القناة التي يشغلها ذيل ubiquitin / ISG15 C ، المحصور بين مجال الإبهام SARS PLpro و أ ما يسمى Blocking Loop (BL) ، الذي يحتوي على بقايا Tyr حرجة (Tyr269 في SARS ، Tyr268 في SARS2 ؛ 

 إن امتداد Tyr ، الذي يفتقر إلى BL في MERS PLpro (الشكل EV1) ، يجعله غير عرضة لبعض مثبطات السارس

 الأهم من ذلك ، أن تسلسل وطول BL ، وجميع المخلفات المتضمنة في تفاعلات المثبط ، متطابقة بين SARS و SARS2 PLpro (الأشكال 5A و EV1 و EV5A و B) ، مما يشير إلى أن مثبطات SARS PLpro قد يكون لها إمكانات مثبطة ضد SARS2 PLpro.

هيكل SARS PLpro مرتبط بالمركب 3j (سماوي / أصفر ، pdb 4ovz (Baez ‐  متراكب مع SARS2 PLpro˜Ub (أزرق / برتقالي). 

يظهر الشكل الداخلي المركب 3j المرتبط بالقرب من الموقع النشط. انظر الشكل EV5A و B لمزيد من التفاصيل.

ب.

التركيب الكيميائي لـ rac5c. انظر الطرق التكميلية الملحق للحصول على التفاصيل حول التوليف المركب والتوصيف.

ج.

تثبيط في المختبر (IC50) لمثبطات SARS2 PLpro. أجريت التجارب باستخدام اختبار HTS (الشكل 4) ، في ثلاث نسخ تقنية في ثلاث تجارب مستقلة.

 تم استخدام متوسط ​​هندسي لتحديد IC.

د.

تم التعبير عن nsp3 كامل الطول من ناقل C - GFP - الموسوم في خلايا HEK293T وعولج بتركيزات متزايدة من rac5c لمدة 24 ساعة. 

يتم تحرير GFP من الطرف C ، ويفترض أن يكون عن طريق نشاط الأنزيم البروتيني nsp3. يمكن اكتشاف Nsp3 بواسطة جسم مضاد لـ SARS / SARS2 PLpro (انظر الشكل EV5E للتحقق من صحة الجسم المضاد).

 تم مسح Lysates من أجل بوليوبيكويتين مرتبط بـ Lys48 مع جسم مضاد خاص بالربط (K48)

قد اخترنا وأعدنا تركيب أشكال راسيمية لثلاثة مركبات أدبية في مرحلة متأخرة ، سميت وفقًا للمنشور السابق  و rac3j و rac3k و rac5c 

كشفت قياسات IC50 التي تم إجراؤها على منصة الفحص الآلي الخاصة بنا عن نشاط مثبط منخفض أو أقل من ميكرومتر لكل مركب مقابل SARS2 PLpro (الشكلان 5B و C و EV5C و D). 

أكد هذا أن مثبطات SARS PLpro تمنع SARS2 PLpro.

تستهدف مثبطات SARS2 PLpro نشاط البروتياز و DUB

Nsp3 هو إنزيم متعدد المجالات بقدرة 215 كيلو دالتون وله العديد من الأنشطة التحفيزية. 

لاختبار ما إذا كان أفضل مثبط ، rac5c (قيمة IC بقيمة 0.81 ميكرومتر ، والتين 5B و C ، و EV5C و D) ، سيكون قادرًا على تثبيط مجال PLpro في سياق nsp3 كامل الطول ، تم التعبير عن البروتين بشكل عابر من C ناقل ged نهائي GFP في خلايا HEK293T.

 تم اكتشاف nsp3 كامل الطول بجسم مضاد خاص بـ SARS / SARS2 PLpro (تم التحقق من صحته في الشكل EV5E) ، وتم تأكيد نشاطه عن طريق الانقسام البروتيني لعلامة GFP (الشكلان 5D و EV5F). 

قلل تعبير Nsp3 من البوليوبيكويتين المرتبط بـ Lys48 ، والذي تم تثبيته بواسطة rac5c بطريقة تعتمد على الجرعة (الأشكال 5D و EV5F و G).

 والأهم من ذلك ، أن معالجة rac5c قللت أيضًا من معالجة بنية nsp3 GFP المعبر عنها ، مما يشير بقوة إلى أن تثبيط PLpro سوف يوقف معالجة البروتينات المتعددة. 

لقد تم إثبات سابقًا أن هذه المثبطات خاصة بـ PLpro على DUBs البشرية (Baez ‐ Santos et al ، 2015) (انظر أيضًا الشكل 4 ب) ، ولم يؤثر العلاج بـ rac5c على البوليوبيكويتين المرتبط بـ Lys48 في غياب تعبير nsp3 (التين ... 5D و EV5F) ، مما يدل بقوة على نشاط nsp3 / PLpro المستهدف لـ rac5c.

B) ، ولم يؤثر العلاج بـ rac5c على البوليوبيكويتين المرتبط بـ Lys48 في غياب تعبير nsp3 (الشكلان 5D و EV5F) ، مما يدل بقوة على نشاط nsp3 / PLpro المستهدف لـ rac5c.

الفعالية المضادة للفيروسات لمثبطات SARS2 PLpro

تم اختبار جميع المركبات الثلاثة لإمكانية تثبيطها في الخلايا الظهارية للكلية القرد Vero المصابة بـ SARS ‐ CoV 2.

 تخضع خلايا فيرو لموت خلوي واسع النطاق عند الإصابة بعدوى السارس CoV 2 على عكس العديد من خطوط الخلايا البشرية حيث يكون تأثير الاعتلال الخلوي (CPE) أقل وضوحًا 

بالإضافة إلى ذلك ، وجدنا أن خلايا Vero كانت حساسة لتركيزات DMSO التي تزيد عن 0.3٪ (حجم / حجم) ، مما يحد من النطاق المفيد الذي يمكن فيه تطبيق المثبطات بسبب انخفاض قابليتها للذوبان (الشكل EV6A). 

لم تظهر المركبات المركبة rac3j و rac3k و rac5c أي سمية على خلايا Vero عند استخدامها في 0.1 ٪ DMSO (مما يتيح التقييم المركب على الخلايا بتركيزات تصل إلى 11 ميكرومتر) ، ولكن زادت السمية مع ارتفاع تركيزات المركب و DMSO (33 ميكرومتر مركب ، في 0.3 ٪ DMSO) (الشكل EV6B).

الشكل EV6: النشاط المضاد للفيروسات للمركبات في الخلايا

بعد ذلك ، تم اختبار المركبات في خلايا Vero المصابة بـ SARS CoV ‐ 2 بتعددية من (MOI) تبلغ 0.1 (الشكل 6 أ) ، مما أدى إلى وفاة حوالي 50 ٪ من سكان الخلايا. تم استخدام Remdesivir (RDV) 

، الدواء الوحيد المتاح المعتمد لعلاج COVID ‐ 19 ، بتركيز 12.5 ميكرومتر  ، مما أدى إلى ~ 90٪ انعكاس لـ CPE المستحث بـ SARS ‐ CoV 2. هيدروكسي كلوروكين (HCQ) ، عند 10 ميكرومتر (Yao et al ، 2020) ، أنقذ CPE أيضًا بنسبة ~ 90 ٪ (الأشكال 6 ب ، و EV6C و D).

 التأثيرات المضادة للفيروسات لمثبطات SARS2 PLpro في نموذج العدوى

أ.

أصيبت خلايا فيرو بـ SARS CoV-2 وتم تحليلها كما هو موضح في الرسوم المتحركة 

ب.

الحد من تأثير السارس ‐ CoV-2 الناجم عن الاعتلال الخلوي باستخدام علاج rac5c و Remdesivir (RDV) وهيدروكسي كلوروكوين (HCQ).

 مطلوب DMSO 0.3 ٪ (v / v) للحفاظ على 33 ميكرومتر rac5c في المحلول (انظر الشكل EV6A و B).

 يتم توفير المتوسط ​​(الخط الأسود) لـ 18 عينة في كل مجموعة ، تمثل 3 تجارب مستقلة مع 6 مكررات بيولوجية لكل تجربة عبر تركيزات مختلفة من rac5c.

 يتم تجميع بيانات HCQ من تجربتين مستقلتين و RDV من تجربة واحدة باستخدام 6 مكررات بيولوجية. 

تم حساب قيم P باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه ، مع اختبار Dunnet العادي اللاحق لمقارنات متعددة بين أذرع العلاج والسيطرة المعالجة المصابة / المركبة باستخدام تباين مجمع واحد.

تركيزات عالية (33 ميكرومتر) من rac5c أو rac3j أو rac3k قللت من السارس ‐ CoV ‐ 2 CPE ، ومن المحتمل أن يكون موت الخلايا المتبقي (حوالي 20 ٪) قد ساهم في السمية الخلفية المرتبطة بتركيزات DMSO العالية الموصوفة أعلاه (الأشكال 6 ب ، و EV6C و D).

 الأهم من ذلك ، بالنسبة لـ rac5c ، استمر العلاج عند 11 ميكرومتر في تركيزات DMSO غير السامة للخلايا (0.1 ٪ DMSO) في إظهار انخفاض ملحوظ في CPE ، مما يشير إلى نشاط مضاد للفيروسات واضح

. بالنسبة إلى rac3j و rac3k ، تقلص تخفيض CPE بتركيزات منخفضة (الشكل EV6C و D).

أفضل تقييم للنشاط المضاد للفيروسات هو تأثير المركب على TCID50 (متوسط ​​جرعة عدوى زراعة الأنسجة) حيث يتم تقييم طاف الخلية من الخلايا المصابة للعدوى الفيروسية المعدية في العدوى الثانوية. RDV (12.5 ميكرومتر) و HCQ (10 ميكرومتر) قلل من العيار الفيروسي بمقدار 100 ‐ و 10 ‐ أضعاف ، على التوالي. 

أظهرت مثبطات SARS2 PLpro ، بتركيزات عالية تبلغ 33 ميكرومتر ، انخفاضًا بمقدار 3-4 لوغاريتمات في العيار الفيروسي المعدية عند 33 ميكرومتر

 على الرغم من أن هذا التأثير يمكن أن يُعزى جزئيًا على الأقل إلى السمية التي تتوسطها السيارة للخلايا . Rac5c عند 11 ميكرومتر ، وهو تركيز يحمي الخلايا من CPE دون التسبب في تسمم الخلية ، قلل من العيار الفيروسي إلى امتداد مماثل مثل علاج RDV و HCQ.

 معًا ، توضح بياناتنا أن تثبيط SARS2 PLpro بجزيئات صغيرة يمكن أن يكون له تأثيرات مضادة للفيروسات مذهلة.

نقاش

تحمل الأنشطة الكيميائية الحيوية والخصائص الهيكلية لمجال PLpro لبروتين SARS CoV ‐ 2 الأساسي nsp3 وعودًا هائلة كهدف لتوليد فئة جديدة من مضادات الفيروسات لفيروسات كورونا. 

الركائز الثلاث المتميزة لـ PLpro ، وهي البروتينات الفيروسية المتعددة ، وإشارات Lys48 ‐ polyubiquitin المتحللة ، وإشارات ISG15 المضادة للفيروسات ، تجعل PLpro مرشحًا ممتازًا للتدخل الدوائي.

معًا ، تؤكد تحليلاتنا البيوكيميائية والهيكلية والطفرية أنه أولاً ، يتم توفير تفضيل ISG15 من خلال موقع ربط SARS2 PLpro S1 Ub / Ubl ، والذي يربط بشكل تفضيلي ISG15CTD من خلال وضع الربط التفاضلي مقارنةً بـ يوبيكويتين.

 ثانيًا ، تستخدم PLpro موقع ربط S2 لتوفير خصوصية رائعة لمادة البوليوبيكويتين المرتبطة بـ Lys48. Monoubiquitin هو ركيزة رديئة مقارنة بـ ISG15 ، ولكن بمجرد تمديده عبر روابط Lys48 يصبح ركيزة مناسبة. 

مجتمعة ، تجعل ميزات PLpro هذه إنزيمًا تفضيليًا ISG15 by (بمقدار 18 ضعفًا تقريبًا) ، والذي يمكنه أيضًا شق البوليوبيكويتين المرتبط بـ Lys48 ، ولكن من غير المرجح أن يزيل تعديلات monoubiquitin.

 تتوافق هذه النتائج مع التحليلات والتركيبات البيوكيميائية التي تم الإبلاغ عنها مؤخرًا والتي تم الإبلاغ عنها مؤخرًا بواسطة مختبر Pegan ) ) ، ومختبر Olsen 

 وتشرح هذه النتائج ميكانيكيًا. .

بالنظر إلى الوفرة النسبية لتعديلات يوبيكويتين و ISG15 في الخلايا ، فإن الاختلاف في النشاط قد يضمن أن إشارات ISG15 الأقل وفرة بكثير يتم قطعها على خلفية سلاسل Lys48 ubiquitin الوفيرة للغاية. 

في الواقع ، يُظهر البروتياز الفيروسي الآخر مثل Lbpro من FMDV (فيروس مرض الحمى والفم) تفضيل ISG15 أكثر وضوحًا 

 حتى داخل فيروسات كورونا ، تختلف أنشطة ISG15 و ubiquitin وأنماط الربط بين السارس و MERS [انظر المناقشة في الشكل EV2 ، وأيضًا

يستهدف Lys48 polyubiquitination الأكثر شيوعًا البروتينات لتحلل البروتوزومال ويلعب أدوارًا مهمة في مسارات الالتهاب. 

تشير العديد من الدراسات إلى السارس PLpro في هذه المسارات ؛ ومع ذلك ، فإن معظم PLpro أو nsp3 في عزلة. 

قد تكون الوظيفة الإضافية لـ PLpro هي تثبيت مجمع النسخ المتماثل الفيروسي الذي يعد nsp3 جزءًا منه ، ويبدو من المعقول أن PLpro قد يعمل على الحفاظ على Lys48 polyubiquitin المتماثل خاليًا.

على الرغم من دور ISG15 كإشارة مضادة للفيروسات ، فإن مساهمتها في الإشارات الالتهابية ، أو دور PLpro في شقها ، ليست مفهومة جيدًا. 

من المتوقع أن يقيد موقع PLpro داخل nsp3 (والنسخ المتماثل) نصف قطر عمله مقارنةً بـ PLpro أو nsp3 المعزول ، مما يزيد من تعقيد تفسير دراسات التعبير خارج الرحم. 

يمكن أن تثبت إعادة تكوين النسخة المتماثلة ، بالاقتران مع طفرات الفصل بين الوظائف المحددة هنا ، أنها مفيدة في الدراسات المستقبلية التي تشريح مساهمات نشاط PLpro تجاه ISG15 مقابل Lys48 ‐ polyubiquitin أثناء العدوى الفيروسية.

بغض النظر عن النشاط المنخفض لـ PLpro تجاه اليوبيكويتين ، نظهر أنه يمكن تطوير شاشة قوية عالية الإنتاجية لـ SARS2 PLpro باستخدام ubiquitin ‐ rhodamine. 

هذا جنبًا إلى جنب مع رؤيتنا الهيكلية يمهد الطريق نحو اكتشاف دواء موجه هيكليًا. 

في الواقع ، في حين أن الأدوية المعتمدة سريريًا التي تم اختبارها هنا قد لا تكون مناسبة لاستهداف PLpro (الشكل 4) ، فإن مركبات الرصاص غير المكررة دوائيًا متاحة بالفعل لاستهداف SARS2 PLpro على وجه التحديد 

 لقد أظهرنا أن أحدث مركبات أدبيات SARS PLpro ، ولا سيما rac5c ، لها فعالية مضادة للفيروسات وتبدو قوية مثل الأدوية التي تستهدف التكاثر الفيروسي (مثل مثبط البوليميريز الفيروسي Remdesivir) ، في الأنظمة القائمة على الخلية التي تم اختبارها. 

سيتعين على الدراسات المستقبلية تقييم استقلاب الدواء والحركية الدوائية والفعالية المركبة في الجسم الحي

كانت النتيجة المهمة المحتملة هي التثبيط الملحوظ بوساطة rac5c لانقسام nsp3 GFP في الخلايا.

 في هذا الإعداد ، يقدم توليد بروتين nsp3 الموسوم كامل الطول مجال PLpro مع موقع واحد لتحليل البروتين ، وسيحتاج PLpro إلى القطع مرة واحدة فقط لتحرير العلامة (أو ثلاث مرات في بيئة فيروسية ، لإنتاج بروتينات nsp1 و nsp2 و nsp3 - هذه أحداث أساسية لبناء التكرار الفيروسي).

 يختلف الانقسام الذاتي اختلافًا جوهريًا عن التحلل المائي لأوبيكويتين أو تعديلات ISG15 التي ، بالمقارنة ، وفيرة وتتجدد باستمرار بواسطة الخلية المضيفة.

كان من المشجع أن rac5c منعت المعالجة الذاتية لـ nsp3 FP GFP لأنها تشير إلى أن مثبط PLpro يمكن أن يستهدف التكاثر الفيروسي بشكل مباشر وفعال. 

علاوة على ذلك ، من المحتمل أن يتم استكمال هذه التأثيرات المباشرة المضادة للفيروسات لمثبطات PLpro عن طريق قمع دور PLpro في تخريب الجهاز المناعي الفطري من خلال تداخله مع الخلية المضيفة ISG15 وإشارات اليوبيكويتين. 

قد تكون مثبطات PLpro مفيدة أيضًا في إعادة (و / أو إعادة التوازن) لاستضافة العمليات المناعية الفطرية التي يتم تحريرها مرضيًا في COVID-19.

المواد والأساليب

البيولوجيا الجزيئية

توليد نواقل التعبير البكتيرية

استند تسلسل SARS ‐ CoV ‐ 2 PLpro (الأحماض الأمينية (aa) 1،563-1،878 ، مع aa E1564 المعين كبقايا 1 ، وفقًا للترقيم المنشور مسبقًا) على polyprotein orf1ab (GenBank: QHD43415) وتم شراؤه ككودون كتلة الجينات الأمثل (IDT) للتعبير البكتيري. 

تم استنساخ PLpro عن طريق الاستنساخ المستقل للربط في ناقل pOPIN ‐ B  باستخدام مجموعة استنساخ In ‐ Fusion HD (Takara Clontech). تم تقديم جميع طفرات PLpro عن طريق الطفرات الموجهة بالموقع باستخدام مجموعة الطفرات الموجهة من موقع Q5 (NEB). 

بالنسبة لتحضير Ub-PA و ISG15CTD-PA ، تم التعبير عن جينات Ub (1–75) و ISG15CTD (79-156) من نواقل pTXB1 كما هو موصوف 

 تم التعبير عن ProISG15 (2–165) و proISG15CTD (79–165) من نواقل pOPIN-B كما هو موضح في

توليد نواقل التعبير عن الثدييات

للتعبير عن الثدييات ، تم إنشاء متغيرات SARS2 PLpro ، و SARS PLpro (aa 1،541–1،855 من polyprotein 1ab) و MERS PLpro (aa 1،482–1،803 من polyprotein 1ab) ، ككتلة جينية مُحسَّنة من الكودون (IDT) للتعبير البكتيري وتم نقلها في pOPINF باستخدام استنساخ In ‐ Fusion HD (Takara Clontech).

 تم استنساخ nsp3 كامل الطولمن ناقل pENTRY إلى ناقل pDEST47 باستخدام استنساخ البوابة مع مزيج LR clonase (Invitrogen) ، وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة.

الكيمياء الحيوية للبروتين وعلم الأحياء الإنشائي

تنقية PLpro

تم تحويل ناقلات التعبير البرية والطفرة PLpro إلى خلايا مختصة بـ Escherichia coli Rosetta 2 (DE3) pLacI (Novagen) ، ونمت الخلايا البكتيرية في وسط 2xYT عند 37 درجة مئوية. .

عند OD 600 = 0.8 ، تم تخفيض درجة الحرارة إلى 18 درجة مئوية وتم إحداث التعبير باستخدام 0.3 ملي مولار IPTG. تم حصاد الخلايا بعد 16 ساعة من الحث وتخزينها عند -20 درجة مئوية.

من أجل التنقية ، تم تعليق الخلايا في محلول تحلل (50 ملي مولار من درجة الحموضة 7.5 ، 300 ملي مول كلوريد الصوديوم) مع استكمال الليزوزيم ، DNaseI وأقراص كوكتيل مثبطات البروتياز الخالية من EDTA (Roche) ومحللة بواسطة صوتنة. 

تمت إزالة Lysates عن طريق الطرد المركزي عند 40000 جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية ، وتم تنقية البروتينات التي تحمل علامات ‐ إما باستخدام عمود HisTrap FF (5 مل ، Cytvia) مع شطف متدرج يزيد عن حجم 5 أعمدة (CV) من المخزن المؤقت A

 ( 20 ملي تريس أس هيدروجيني 7.5 ، 300 ملي كلوريد الصوديوم و 10 ملي مولار إيميدازول) إلى المخزن المؤقت B (20 مم تريس أس هيدروجيني 7.5 ، 300 ملي كلوريد الصوديوم و 400 ملي إيميدازول) ،

 أو مع راتنج Ni NTA HisBind (EMD Millipore) التصفية مع المخزن المؤقت B (2 × 10 مل). 

تم استكمال الكسور المجمعة بالبروتياز الخاص به ‐ 3C من أجل انقسام العلامة وغسلها طوال الليل عند 4 درجات مئوية 

(للوزن: 50 ملي مولار تريس pH 7.5 ، 300 ملي كلوريد الصوديوم ، 5 ملي مولار مركابتو إيثانول (bME) ،

 للطفرات:

 20 ملي مولار HEPES درجة الحموضة 7.5 ، 300 ملي كلوريد الصوديوم و 10 ملي مولار بي إم إي). 

تمت إزالة البروتياز الخاص به ‐ 3C وعلاماته بواسطة راتنج Ni ‐ NTA HisBind (EMD Millipore) ، وتمت تنقية البروتينات بشكل أكبر عن طريق كروماتوجرافيا استبعاد الحجم باستخدام عمود HiLoad 16/600 Superdex 75 بيكوغرام (GE Healthcare) متوازن مع مخزن مؤقت للتخزين (20 ملي مولار) HEPES درجة الحموضة 7.5 ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، 1 مم TCEP). 

تم تركيز عينات البروتين ، ومجمدة وميضها في نيتروجين سائل وتخزينها عند -80 درجة مئوية.

فحص التحول الحراري

تم إجراء فحوصات التحول الحراري لمراقبة الجودة بعد تنقية PLpro بالوزن والطفرات ، باستخدام Tycho NT.6 (تقنيات NanoTemper).

 تم قياس وزن PLpro والطفرات عند 1 ميكرومتر في المخزن المؤقت. تم حساب درجات حرارة الانعطاف لكل بروتين بواسطة برنامج Tycho NT.6 (1.2.0.750). تم قياس التكرارات التقنية في تجربتين مستقلتين. تم تحليل البيانات باستخدام GraphPad Prism.

تنقية His6 ‐ proISG15 و His6 proISG15CTD

تم التعبير عن proISG15 و proISG15CTD كما هو موصوف أعلاه ولكن تم حثه باستخدام 0.2 ملي مولار IPTG وتم تعليقه في المخزن المؤقت C (50 ملي مولار تريس pH 7.5 ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، 2 ملي مولار من كلوريد الصوديوم) 

التخزين المسبق عند -20 درجة مئوية. 

تم إجراء تنقية التقارب كما في PLpro ولكن مع التعديلات التالية. 

تم غسل راتينج HisTrap FF مع محلول C مكمل بـ 15 ملي إيميدازول وتم التصفية منه بتدرج خطي قدره 10 CV من المخزن المؤقت C إلى المخزن المؤقت D (المخزن المؤقت C مكمل بـ 300 ملي إيميدازول). 

تم تخفيف البروتينات المخففة بمقدار 10 ‐ أضعاف إلى محلول ملح منخفض (50 ملي تريس أس هيدروجيني 8.0 ، 30 ملي مول كلوريد الصوديوم ، 2 ملي مولار بي إم إي) وتم تمريرها فوق عمود ResourceQ (Cytvia). 

تم تركيز البروتينات المزالة وتنقيتها بشكل أكبر بواسطة كروماتوجرافيا استبعاد الحجم (HiLoad 16/600 Superdex 75 pg ، Cytvia) في Buffer C. 

تم تركيز البروتين المحتوي على الكسور ، وتجميدها بالفلاش وتخزينها عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام الإضافي.

جيل يوبيكويتين و ISG15CTD 

تم التعبير عن بروتينات Ub intein و ISG15CTD ‐ intein كما في PLpro. 

تم تعليق الكريات الخلوية في المخزن المؤقت E (20 ملي مولار HEPES ، 50 ملي مولار NaOAc درجة الحموضة 6.5 ، 75 ملي كلوريد الصوديوم) و Buffer F (50 ملي مولار HEPES ، 100 ملي مولار NaOAc درجة الحموضة 6.5) ، على التوالي.

تم تحضير Ub ‐ MesNa (2 مركابتوإيثان سلفونات كملح صوديوم) وبعد ذلك Ub PA كما هو موصوف سابقًا

. تم تحضير مسبار الانتحار ISG15CTD البشري (79-156) ‐MesNa (ISG15CTD ‐ MesNa) ومسبار الانتحار ISG15CTD-PA كما هو موضح سابقًا 

خضعت التفاعلات المكتملة لكروماتوجرافيا استبعاد بالحجم النهائي (HiLoad 16/600 Superdex 75 pg ، Cytvia) في Buffer E (Ub ‐ PA) أو Buffer F (matISG15CTD ‐ PA).

 تم تركيز الكسور الناتجة وتجميدها بالوميض وتخزينها عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام الإضافي.

تحضير مجمع PLpro ~ Ub و PLpro ISG15CTD للبلورة

تم تحضين PLpro المنقى مع زيادة 3 × مولار من Ub PA أو ISG15CTD ‐ PA عند RT لمدة ساعتين. تم فصل المسبار غير المتفاعل عن المعقد عن طريق كروماتوجرافيا استبعاد الحجم (Superdex 75 زيادة 10/300 GL) إلى 20 مم تريس

 pH 7.5 ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، 1 مم TCEP (PLpro ~ Ub) أو 20 مم HEPES درجة الحموضة 7.5 ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، تم تركيز 1 ملي مولار من TCEP (PLpro ~ ISG15CTD) ، وتم تركيز المجمعات المزالة إلى 4 مجم مل 

لـ PLpro ~ Ub و 5 مجم مل من ml 1 أو 8 مجم مل لـ PLpro ~ ISGCTD للتبلور.

التبلور

تم إجراء فحص التبلور في مركز التبلور التعاوني (C3) التابع لـ CSIRO في ملبورن ، أستراليا. 

بالنسبة لـ PLpro ~ Ub عند 4 مجم مل ، نمت بلورة واحدة في 30٪ (وزن / حجم) PEG 4000 ، 0.2 م أسيتات الصوديوم ، 0.1 م تريس كلوريد الأس الهيدروجيني 8.5 ، في بئر 96 ‐ ، لوحة انتشار بخار قطرة (150 nl البروتين إلى 150 nl محلول خزان) عند 20 درجة مئوية.

 تم تجميد البلورة باستخدام 20 ٪ (وزن / حجم) PEG 4000 ، 0.2 M أسيتات الصوديوم ، 0.1 M Tris كلوريد الأس الهيدروجيني 8.5 و 25 ٪ (حجم / حجم) الجلسرين قبل التزجيج في النيتروجين السائل. 

بالنسبة لـ PLpro ~ ISG15CTD ، نمت البلورات الأولية بتركيزات كل من 5 و 8 مجم من مركب مل ، في عدة ظروف تحتوي على 0.2 مولار من الليثيوم أو كبريتات الأمونيوم ، و 25 ٪ (وزن / حجم) PEG 3350 و bis ‐ tris كلوريد pH 5.5-6.5 ، 

عند 20 درجة مئوية. 

تم حل الهيكل من بلورة مكررة في صفيحة معلقة بقطر 24 ميكرون باستخدام مركب بروتين 5 مجم مل ينمو في 0.2 مولار من كبريتات الليثيوم ، 25٪ (وزن / حجم) PEG 3350 و 0.1 مولار مكرر تريس كلوريد الأس الهيدروجيني 6.5 و نسبة البروتين إلى الخزان 1-0.5 ميكرولتر.

 تمت حماية البلورة تدريجياً باستخدام المحلول الأم المضاف إليه 15٪ (حجم / حجم) جلسرين كخطوة أولى و 28٪ (حجم / حجم) جلسرين كخطوة ثانية ، قبل التزجيج في النيتروجين السائل.

 تم تنقيح كلا الهيكلين في البداية عن طريق التلدين المحفز الديكارتي بعد تحسين الجسم الصارم. 

لكلا المجمعين ، تم ضبط قيود البنية الثانوية وتم استخدام بنية apo لـ SARS2 PLpro (pdb 6wrh ، غير منشور) كنموذج مرجعي. 

تم تعيين معلمات TLS لمجموعة TLS واحدة لكل سلسلة. 

بالنسبة لـ SARS2 PLpro ~ ISGCTD ، تم استخدام تحسين إضافي لمحطة التحكم بالشبكة في كل دورة تحسين. 

من أجل الارتباط التساهمي لـ propargylamide بالمحفز Cys111 لـ SARS2 PLpro في كل هيكل ، تم استخدام قيود هندسية لـ propargylamide (AYE) المشتقة من كوع PHENIX وملف معلمة يحدد الروابط. 

تم التحقق من صحة النماذج باستخدام MolProbity ) و Coot الذي يشير إلى PLpro ~ Ub بعد إحصائيات مؤامرة Ramachandran: 0.0٪ القيم المتطرفة ، 2.63٪ المسموح بها و 97.37٪ المفضل و لـ PLpro ~ ISGCTD: 0.0٪ القيم المتطرفة ، 2.60٪ المسموح بها ، 97.40 ٪ مفضل. تم إنشاء الأشكال الهيكلية باستخدام PyMol. يمكن

فحوصات نشاط PLpro

نشاط PLpro DUB المستند إلى الجل وفحوصات خصوصية السلسلة

تم إجراء فحوصات الانقسام القائمة على الهلام كما هو موضح سابقًا  مع التعديلات التالية. 

بدأت التفاعلات عند درجة حرارة الغرفة (23 درجة مئوية) في حجم نهائي قدره 150 ميكرولتر (لمقايسة النوعية) أو 350 ميكرولتر (لفحوصات دورة زمنية أطول) و 20 ملي مولار من الأس الهيدروجيني 7.5 ، 100 ملي كلوريد الصوديوم ، 10 ملي مولار DTT كمخزن رد الفعل.

 تم تجميع ركائز Triubiquitin إنزيميًا كما هو موضح سابقًا 

 كانت تركيزات الإنزيم النهائي والركيزة 0.25 و 2 ميكرومتر على التوالي. 

تم إيقاف التفاعلات في النقاط الزمنية المحددة عن طريق خلط 20 ميكرولتر من التفاعل مع 20 ميكرولتر 2 × محلول عينة NuPAGE LDS (Invitrogen) وتحليلها بواسطة SDS – PAGE (Invitrogen NuPAGE ™ 4–12٪ Bis ‐ Tris) وتلطيخ Coomassie (Instant Blue ، إكسبيديون).

بالنسبة للتحليل الكمي القائم على الهلام ، تم تحويل صور جل Coomassie الملطخة إلى التدرج الرمادي وتم قياس شدة النطاق باستخدام ImageLab ™ (Bio ‐ Rad). 

تم طرح شدة الخلفية تلقائيًا باستخدام خط أساسي بالنسبة إلى أدنى نطاق تباين لكل هلام. 

ثم تم تسوية القيم لنطاق PLpro في كل حارة. 

تم حساب تركيزات الركيزة المتبقية فيما يتعلق بتركيز الركيزة عند النقطة الزمنية صفر (100٪). تم رسم القيم الناتجة بمرور الوقت ، واستخدمت القيم الأولية داخل النطاق الخطي لحساب مقاييس النشاط النسبية.

جيل K48 ‐ diUb ‐ TAMRA

تم إنشاء كاشف استقطاب التألق K48 ‐ diUb ‐ TAMRA (FP) ، الذي يتميز بوصلة ترايزول غير قابلة للتحلل بالماء بين مجالي Ub construct ، من خلال إنشاء K48 diUb غير القابل للتحلل بالماء وفقًا للبروتوكولات التي أبلغ عنها 

 تم بعد ذلك تنشيط الطرف C من diUb القريب وربطه ببتيد TAMRA ‐ KG باتباع البروتوكول الذي أبلغ عنه (Geurink et al ، 2012) لإنتاج رابطة الأيزوببتيد الأصلية بين ε ε أمين ليسين الببتيد والجليسين الكربوكسيل للديوب غير القابل للتحلل بالماء.

فحوصات نشاط PLpro القائمة على الاستقطاب الفلوري

تم إجراء فحوصات FP باستخدام Ub KG ‐ TAMRA (UbiQ bio) ، K48 ‐ diUb ‐ TAMRA (انظر أعلاه) ، الماوس ISG15 KG ‐ TAMRA (UbiQ bio) و ISG15CTD ‐ TAMRA ) لتحديد الحفاز كفاءات PLpro wt والطفرات. 

للمقايسة حجم صغير ، قاع أسود غير ملزم ، تم استخدام ألواح بئر 384 ‐ ، وتم قياس التفاعلات على قارئ لوحة CLARIOstar plus (BMG Labtech) باستخدام إعدادات بصرية لـ TAMRA fluorophore 

(الإثارة: 540 نانومتر ، الانبعاث: 590 نانومتر). 

قبل كل قياس ، تمت الإشارة إلى إعدادات الأداة إلى تحكم 50 ملي بي كغ - تامرا بتركيز 50 نانومتر.

تم استخدام جميع الركائز بتركيز نهائي قدره 150 نانومتر ، بينما تباينت سلسلة التخفيف لتركيزات الإنزيم وفقًا للركيزة (10–0.156 ميكرومتر من PLpro لـ Ub-TAMRA ؛ 1000–15.63 نانومتر لـ K48 ديوب TAMRA ؛ 100– 1.56 نانومتر للانقسام ISG15‐ و ISG15CTD ؛ 250-3.90 نانومتر لانقسام ISG15CTD ‐ لتحديد الكفاءة التحفيزية). 

تم تخفيف الإنزيم (SARS2 PLpro wild type والطفرات) والركائز في محلول الفحص (20 مم HEPES درجة الحموضة 7.5 ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، 1 ملي TCEP ، 50 ميكروغرام مل BSA) إلى 2 × تركيزات ، وبدأت التفاعلات عند الإضافة من 2 × إنزيم إلى 2 × ركيزة في الحجم النهائي 15 ميكرولتر. 

تم قياس الخواص الحركية في ثلاث نسخ تقنية تزيد عن 60 دقيقة مع قراءة واحدة في الدقيقة في تجربتين مستقلتين على الأقل مع العدد الدقيق الموضح في أساطير الشكل. 

لتحديد الكفاءة التحفيزية لنوع SARS2 PLpro البري على ISG15CTD ، تم إجراء قياسين من أربعة قياسات مستقلة في نسخ تقنية مكررة ، بسبب قيود الركيزة.

تم تحليل البيانات باستخدام برنامج CLARIOstar MARS و Microsoft Excel و GraphPad Prism (الإصدار 8.3.1).

 تم تصحيح قيم استقطاب التألق المقاسة فارغة (باستخدام عنصر تحكم مؤقت فقط) وتحويلها إلى تباين (مللي أمبير) باستخدام برنامج CLARIOstar MARS.

 تم حساب متوسط ​​التكرارات التقنية وتركيبها من خلال تركيب منحنى غير خطي باستخدام تحلل أحادي الطور في منشور GraphPad. 

ثم تم رسم ثوابت المعدل المحدد (kobs) فوق تركيزات الإنزيم وتم تركيبها باستخدام الانحدار الخطي لتحديد الكفاءة التحفيزية kcat / KM كمنحدر.

غربلة عالية الإنتاجية

فحوصات نشاط Ub-Rhodamine PLpro لـ HTS

لفحص HTS ، تمت مراقبة نشاط PLpro في اختبار شدة مضان متجانس باستخدام الركيزة Ub ‐ Rhodamine110Gly (UbiQ bio ، يشار إليها هنا باسم Ub ‐ Rhodamine).

 تم إجراء التجارب إما في 384 بئر أو 1536 صفائح سوداء غير ملزمة جيدًا (Greiner 784،900 و 782،900 ، على التوالي) بحجم تفاعل نهائي قدره 6 ميكرولتر. 

احتوى المخزن المؤقت للمقايسة على 20 ملي مولار تريس (درجة الحموضة 8) ، 1 ملي مولار TCEP ، 0.03٪ (وزن / حجم) BSA و 0.01٪ (حجم / حجم) تريتون ‐ X.

تمت إضافة PLpro بتركيز نهائي قدره 50 نانومتر إلى الألواح (تحضير ألواح الفرز الموصوفة أدناه) واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.

 تمت إضافة Ub Rhodamine (التركيز النهائي 100 نانومتر) لبدء التفاعل وتحضينها لمدة 12 دقيقة عند درجة حرارة الغرفة. 

لمقايسات نقطة النهاية ، تم إيقاف التفاعل بإضافة حمض الستريك المائي (1 ميكرولتر) بتركيز نهائي قدره 10 ملي مولار.

 تم الاستغناء عن جميع الكواشف باستخدام CERTUS FLEX (v2.0.1 ، Gyger) ، وتم طرد الصفيحات الدقيقة باستخدام جهاز الطرد المركزي Microplate (Agilent). 

تمت مراقبة التفاعل عن طريق زيادة التألق (الإثارة 485 نانومتر والانبعاث 520 نانومتر) على PHERAstar® (v5.41 ، BMG Labtech) باستخدام الوحدة البصرية FI 485520.

تم إجراء شاشة HTS بقياس واحد لكل مركب في ثلاث تجارب مستقلة.

في شاشة العداد ، تم استخدام إنزيم إزالة التكوُّن USP21 (التركيز النهائي 5 نانومتر) ضمن نفس الإعداد ، ولكن باستخدام وقت حضانة يبلغ دقيقتين بعد إضافة UbRhodamine110 قبل إيقاف التفاعل. تم إجراء شاشة العداد والتأكيد مع 3-6 مكررات تقنية في تجربتين مستقلتين.

تم إجراء شاشة unter وشاشة التأكيد مع 3-6 مكررات تقنية في تجربتين مستقلتين.

إعداد الشاشة وتحليل البيانات

قمنا بتقييم نشاط 5،577 مركبًا موجودًا في مكتبات الأدوية المعروفة المتاحة تجاريًا (Sigma ‐ Aldrich LOPAC و Tocris و Prestwick) بالإضافة إلى مجموعات منسقة داخليًا من الأدوية المعتمدة من إدارة الأغذية والعقاقير (FDA) والمركبات المتقدمة قبل السريرية 

حدد تحليل هذه المكتبات 3727 مركبًا فريدًا. تم الحصول على المركبات من Compounds Australia ، حيث يتم تخزينها في ظل ظروف بيئية قوية.

تم تحضير لوحات الفحص الجاهزة بواسطة مركبات اكتشاف جافة في DMSO باستخدام موزع صوتي Echo® (LabCyte). 

تم اختبار المركبات عند 4.2 ميكرومتر في 2 ٪ (حجم / حجم) DMSO النهائي. 

تم تشغيل الشاشة باستخدام أدوات مدمجة مع برنامج Momentum Laboratory Automation

تم تطبيع البيانات إلى 2 ٪ (ت / ت) DMSO (تحكم سلبي ، 0 ٪ تثبيط) و 100 ميكرومتر rac5c (تحكم إيجابي ، تثبيط 100 ٪). تمت مراقبة جودة فحص الشاشة من خلال حساب Z ′ القوي بالصيغة التالية حيث تشير (+) إلى عناصر التحكم الإيجابية (إشارة منخفضة) ، (-) تشير إلى عناصر التحكم السلبية (إشارة عالية) و MAD هو متوسط ​​الانحراف المطلق:

حيث MAD = 1.4826 × الوسيط (القيمة المطلقة (x - الوسيط (x))).

تم استبعاد اللوحات من التحليل إذا كانت Z قوية <0.5. تم اختيار الزيارات على أنها> 4 × MAD على متوسط ​​التحكم السلبي.

لتحديد فاعلية المثبطات ، تم إجراء سلسلة من 10 نقطة ، 1: 3 تخفيفات متسلسلة من أعلى تركيز بداية من 100 ميكرومتر. 

تم تزويد منحنيات المعايرة بمقدار 10 نقاط بنموذج انحدار غير خطي لوجستي 4 معلمات ، و IC المبلغ عنه هو نقطة انعطاف المنحنى.

لدراسات القائمة على الخلايا ومقايسات العدوى

خطوط الخلايا المستخدمة

عرضت خلايا HEK293T و Vero (CCL ‐ 81) أشكال الخلايا المتوقعة وتم إرسالها للتحقق من صحتها إلى منشأة Garvan Molecular Genetics

تم فحص خطوط الخلايا على أساس شهري لتلوث الميكوبلازما باستخدام مجموعة PlasmoTest (InvivoGen) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. 

كانت جميع الخلايا المستخدمة خالية من الميكوبلازما.

زراعة الخلايا

لدراسات العدوى ، تم زراعة خلايا Vero (CCL ‐ 81) في Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM + 1 gl 1 D glucose ، l ‐ glutamine and 110 mg l − 1 sodium pyruvate؛ Gibco) مكمل بـ 10٪ (v / v) تسخين مصل بقري جنيني معطل (FBS ؛ Sigma ‐ Aldrich) ، 100 وحدة U مل بنسلين و 100 مجم مل ستربتومايسين عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. 

تم زرع خلايا Vero بحجم 100 ميكرولتر DMEM في زراعة الأنسجة - تمت معالجتها بألواح بئر مسطح قاع 96 درجة (فالكون) بكثافة 1 × 104 خلية / بئر وتم حضنها طوال الليل قبل الإصابة و / أو العلاج عند التقاء.

تم زراعة خلايا HEK293T DMEM بنسبة 10 ٪ (حجم / حجم) FBS (Gibco) ، والبنسلين (100 U مل) والستربتومايسين (100 ميكروغرام مل) عند 37 درجة مئوية مع 10 ٪ من ثاني أكسيد الكربون. 

تم زرع الخلايا في 6 أو 24 أو 24 بئر جيدًا وتم نقلها باستخدام نواقل pOPINF التي تشفر MERS PLpro أو SARS PLpro أو SARS CoV pro 2 PLpro أو ناقل pDEST47 لترميز nsp3 GFP عندما كانت الخلايا عند 70-80 ٪ التقاء مع 

Lipofectamine 3000 (Invitrogen) حسب تعليمات الشركة الصانعة. 48 ساعة بعد تعداء الخلايا ، تم حصاد الخلايا للتخثر المناعي.

السمية الخلوية والفعالية المضادة للفيروسات عن طريق مقايسة موت الخلية بإطلاق LDH

تم تحديد قابلية بقاء غير المصابة والمركبة (DMSO) أو مثبط Bcl2 AB ABT 199 ومثبط Mcl ‐ 1 S63845 المعالج ، أو غير المصابة و SARS ‐ CoV ‐ 2 المصابة و / أو مثبط PLpro تم تحديد خلايا Vero المعالجة باستخدام CytoTox 

96® Non فحص السمية الخلوية المشعة (بروميغا) 72 ساعة بعد العدوى / العلاج. 

تم حساب النسبة المئوية للخلايا الحية بمقارنة إطلاق LDH للخلايا الباقية في الخلايا المصابة و / أو المعالجة بإطلاق LDH لخلايا التحكم غير المصابة أو غير المعالجة. 

تم استخدام برنامج Prism 8 (GraphPad) لإجراء اختبارات إحصائية

 تمت مقارنة المجموعات

عدوى السارس CoV ‐ 2 والعلاج المثبط

تم الحصول على SARS ‐ CoV ‐ 2 من معهد بيتر دوهرتي للعدوى والمناعة (ملبورن ، أستراليا) ، حيث تم عزل الفيروس من مسافر من ووهان وصل إلى ملبورن وتم نقله إلى المستشفى في أوائل عام 2020.

 تم استخدام المواد الفيروسية لتلقيح فيرو / خلايا hSLAM للثقافة والتوصيف والمشاركة السريعة للعزل 

تم زرع خلايا Vero واستراحها طوال الليل حتى التقاء في أطباق بئر مسطّحة بقاع 96 درجة وغسلها مرتين باستخدام DMEM خالٍ من المصل وإصابة بـ SARS ‐ CoV ‐ و MOI بنسبة 0.1 في 25 ميكرولتر من وسط خالٍ من المصل.

 تمت زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون لمدة 30 دقيقة. تم تزويد الخلايا بـ 150 ميكرولتر من الوسط الخالي من المصل الذي يحتوي على مركبات مثبطات PLpro بتركيزات مختلفة في ستة مكررات لكل تركيز. 

تمت مراقبة الخلايا يوميا عن طريق الفحص المجهري الضوئي للتغيرات المورفولوجية الناتجة عن تأثير الفيروس الخلوي. 

تم تقييم جدوى الخلايا في اليوم الثالث بعد العدوى / العلاج عن طريق مقايسة موت خلية إطلاق LDH كما هو موضح أعلاه.

قياس الجرعة المعدية المتوسطة من زراعة الأنسجة (TCID50)

تم حصاد طاف ثقافة خلية فيرو لمقايسات عدوى / علاج السارس CoV ‐ 2 بعد يومين من العدوى / العلاج وتم تخفيفها في 5 × 1: 7 تخفيفات متسلسلة في صفيحة دائرية قاع 96 (فالكون) وستة مكررات لكل تخفيف.

 تم زرع خلايا Vero واستراحها طوال الليل حتى التقاء في أطباق مسطحة قاع 96 درجة جيدًا وغسلها مرتين باستخدام DMEM خالٍ من المصل. 

تمت إضافة 25 ميكرولتر من الفيروس المخفف متسلسلًا إلى الخلايا المغسولة وزرعها عند 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون لمدة 30 دقيقة قبل أن تُغطى الخلايا بـ 150 ميكرولتر من وسط خالٍ من المصل.

 تم رصد الخلايا في اليوم الثاني بعد الإصابة / العلاج بالمجهر الضوئي للتغيرات المورفولوجية الناتجة عن تأثير الفيروس الخلوي.

 تم تعريف تركيز الفيروس حيث تظهر 50٪ من الخلايا CPE مقارنة بالخلايا غير المعالجة كعامل TCID50.

يتم إجراء حساب TCID50 باستخدام طريقة سبيرمان وكاربر ، والتي توفر الانحراف المتوسط ​​والمعياري بعد تسجيل 300 بئر لكل عقار (CPE أم لا) عبر نطاق التخفيفات.

مناعي

تم إنشاء Lysates عن طريق التحلل في 50 ملي مولار Tris ‐ Cl ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، 1 ٪ (حجم / حجم) NP 40 مع مثبطات الأنزيم البروتيني الكاملة (Roche) وتم قياسها بواسطة اختبار BCA كما هو موضح. تم إجراء SDS-PAGE مع ما بين 

20 و 70 ميكروغرام من محلول البروتين لكل بئر. بعد SDS-PAGE ، تم نقل المواد الهلامية إلى 0.2 ميكرومتر من أغشية PVDF باستخدام نظام Trans-Blot Turbo (Bio-Rad).

 تم حظر الأغشية في مسحوق حليب 5٪ (وزن / حجم) في محلول ملحي مخزّن من Tris مع 0.05٪ (حجم / حجم) توين 20 (Sigma ، TBS T) لمدة ساعة واحدة ثم تم تحضينها طوال الليل في جسم مضاد أولي مخفف في 5٪ (v / v) BSA في TBS ‐ T (جسم مضاد PLpro ، دجاج متعدد النسيلة ، 1: 250 (مستشعرات الحياة ، # AB ‐ 0602‐0250) ؛ جسم مضاد ‐ Ubiquitin Lys48 محدد (Apu2) ، أرنب وحيد النسيلة ، 1: 1،000 (Sigma ‐Aldrich ، # 05‐1307) ؛ جسم مضاد أحادي النسيلة للفأر GAPDH (6C5) ، 1: 3000 (Invitrogen ، # AM4300) ؛ جسم 

مضاد لـ GFP مضاد للدجاج متعدد النسيلة ، 1: 1،000 (Abcam ، # ab13970)). بعد غسل 3 TBS-T ، تم تحضين الأغشية بأجسام مضادة ثانوية مترافقة في TBS ‐ T لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة الغرفة (IRDye 800CW الماعز المضاد للفأر

 IgG ثانوي ، 1: 10000 (Li ‐ Cor ، # 925 #32210) ؛ مضاد للماعز ‐ دجاج IgY ‐ HRP ، 1: 10000 (SantaCruz ، # sc ‐ 2428) ؛ أرنب IgG HRP ، 1: 10000 (GE Healthcare ، # NA934VS)). 

بعد ثلاث عمليات غسل إضافية في TBS-T ، تم تطوير الأغشية مع الكشف عن التألق أو باستخدام ركيزة اللمعان الكيميائي Clarity Western ECL (Bio Rad) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة باستخدام Chemidoc (Bio Rad).