فوائد حمض D- الأسبارتيك للرجال

 

مضاد الهيستامين أزيلاستين ، الذي تم تحديده عن طريق إعادة استخدام الأدوية الحاسوبية ، يمنع عدوى السارس- CoV-2 في أنسجة أنف الإنسان المعاد تكوينها في المختبر

نبذة مختصرة

معلومات أساسية يمثل جائحة COVID-19 تهديدًا هائلاً لأنظمة واقتصادات الرعاية الصحية في جميع أنحاء العالم ، مما يتطلب بشكل عاجل استراتيجيات وقائية وعلاجية فعالة. 

على عكس تطوير اللقاحات والأدوية الجديدة التي تستهدف على وجه التحديد SARS-CoV-2 ، يمكن أن توفر إعادة توظيف الأدوية المعتمدة أو المختبرة سريريًا حلاً فوريًا.

الأساليب قمنا بتطبيق نهج حسابي جديد للبحث بين الأدوية المعتمدة والمختبرة سريريًا من قاعدة بيانات DrugBank. 

تم اختيار المرشحين بناءً على تناسق شانون الانتروبيا وملامح النشاط المحددة مسبقًا لثلاثة جزيئات صغيرة مع نشاط مثبت ضد SARS-CoV ومجموعة بيانات منشورة. 

تم اختبار النشاط المضاد للفيروسات لعقار تم التنبؤ به ، azelastine ، في المختبر في فحوصات عدوى SARS-CoV-2 مع الخلايا الظهارية للكلية القرد Vero E6 والأنسجة الأنفية البشرية المعاد تشكيلها. 

تم تقييم التأثير على التكاثر الفيروسي عن طريق القياس الكمي للجينومات الفيروسية بواسطة قطيرات PCR الرقمية.

النتائج: 

حدد النهج الحسابي الذي يتضمن أربعة استفسارات مستقلة عائلات الأدوية الرئيسية ، في أغلب الأحيان وبأزياء متداخلة مضادة للعدوى ، ومضادة للالتهابات ، ومضادة لارتفاع ضغط الدم ، ومضادة للهستامين ، وعقاقير نشطة عصبيًا. 

تم توقع Azelastine ، وهو أحد حاصرات مستقبلات الهيستامين 1 ، في شاشات متعددة ، وبناءً على ملف أمانه الجذاب وتوافره في تركيبة الأنف ، تم اختياره للاختبار التجريبي. 

قلل Azelastine بشكل كبير من تأثير اعتلال الخلايا وعدوى SARS-CoV-2 لخلايا Vero E6 مع EC50 من ∼6 ميكرومتر في كل من وضع وقائي وعلاجي.

 علاوة على ذلك ، كان الأزيلاستين الموجود في رذاذ الأنف المتاح تجاريًا والذي تم اختباره بتخفيف 5 أضعاف فعالًا للغاية في تثبيط الانتشار الفيروسي في أنسجة الأنف البشرية المصابة بفيروس SARS-CoV-2.

التفسيرات يمكن اعتبار Azelastine ، وهو مضاد للهستامين ، متوفر في بخاخات الأنف المطورة ضد التهاب الأنف التحسسي ، بمثابة وقاية أو علاج موضعي لاستعمار الأنف مع SARS-CoV-2. 

على هذا النحو ، يمكن أن يكون مفيدًا في الحد من انتشار الفيروس والوقاية من COVID-19. في النهاية ، يجب إثبات فائدته المحتملة في الدراسات السريرية.

المقدمة

يمثل وباء COVID-19 (مرض فيروس كورونا 2019) تهديدًا عالميًا للصحة العامة ويتطلب استجابة فورية لتطوير أساليب وقائية وعلاجية فعالة بسرعة. 

نظرًا لضغوط الوقت الهائلة ، فإن المسار المحدد لاكتشاف الأدوية وتطويرها غير ممكن ، كما أن إعادة توظيف الأدوية المعتمدة إكلينيكيًا هي بديل جذاب.

إعادة استخدام الأدوية / إعادة تحديد موضعها يعني تحديد مؤشرات جديدة للأدوية الموجودة. إنه خيار واعد لتحديد سريع للعوامل العلاجية الجديدة .

1 هناك ثلاثة مناهج رئيسية: 

1. ، الاختيار العقلاني على أساس معرفة طريقة عمل دواء معين والتسبب في المرض ، 

2. ، كبير -مقياس فحص الإنتاجية العالية في الفحوصات المخبرية للوظيفة المطلوبة ، و 3. ، التنبؤ الحسابي باستخدام قواعد بيانات الأدوية. 

تم تطبيق كل هذه الأدوية على COVID-19 ويتم بالفعل اختبار العديد من الأدوية في الدراسات السريرية. الدواء الوحيد الذي حقق فائدة كبيرة للبقاء على قيد الحياة ضد COVID-19 حتى الآن هو ديكساميثازون .

2 ومع ذلك ، فهو ليس دواء حقيقي

مثال على تغيير الغرض ، منذ أن تم استخدام الإشارة الأصلية وطريقة العمل المضادة للالتهابات المعروفة للجلوكوكورتيكويد لترويض الالتهاب المفرط الذي يميز COVID-19. 

يتم اختبار العديد من الأدوية الأخرى المضادة للالتهابات سريريًا ، على سبيل المثال الأجسام المضادة وحيدة النسيلة ضد السيتوكينات المؤيدة للالتهابات ، مثل IL-6. 

النهج العقلاني ، وهو نوع من حالات إعادة استخدام المواد شبه الدوائية ، هو استخدام مركبات مضادة للفيروسات مباشرة ، مثل ريمديسفير. 

كان Remdesivir عقارًا تجريبيًا (المرحلة 3) في بداية جائحة COVID-19 ، وقد تم تطويره في الأصل ضد فيروس الإيبولا ، وهو أيضًا فيروس RNA مثل SARS-CoV-2 وأثبت نشاطه الفعال ضد SARS-CoV- 2 في كل من نماذج العدوى في المختبر والحي (تمت مراجعتها في 3). 

على الرغم من اعتباره علاجًا في COVID-19 ، إلا أن فائدته السريرية متواضعة .

3 والمثال الكلاسيكي على إعادة استخدام الأدوية الحقيقية ضد COVID-19 هو الكلوروكين / هيدروكسي كلوروكوين ، 

الأدوية المضادة للملاريا التي ثبت أنها فعالة ضد فيروسات كورونا من الأوبئة السابقة وأيضًا ضد SARS-CoV-2.4 بالإضافة إلى ذلك ، 

يستخدم هيدروكسي كلوروكين أيضًا كدواء مضاد للالتهابات في مرضى المناعة الذاتية .5 إلى جانب القلق بشأن الآثار الجانبية الشديدة المحتملة ، 

أثبتت الدراسات السريرية المصممة جيدًا بشكل كاف أن هيدروكسي كلوروكين غير فعال في الوقاية من COVID- أو علاجه.

 يمكن تفسير التناقض بين النشاط في المختبر والفعالية السريرية لهذه الأدوية من خلال البيانات الحديثة التي توضح نقص الفاعلية ضد عدوى SARS-CoV-2 في الخلايا الظهارية التنفسية .

7 ، 8 نهج عقلاني آخر ، ولكن حالات إعادة توظيف الأدوية حقًا هي مثبطات الإنزيم المحول للأنجيوتنسين 2 (ACE2) ومستقبل الأنجيوتنسين أو المضادات المستخدمة على نطاق واسع في العلاج المضاد لارتفاع ضغط الدم. 

نظرًا لأن الإنزيم المحول للأنجيوتنسين 2 هو مستقبل دخول SARS-CoV-2 ، ولكنه يظهر أيضًا أنه يحمي من تلف الرئة في النماذج الحيوانية 9 ، يتم النظر في التأثيرات المفيدة والمحتملة لتعزيز المرض.

على الرغم من عدم تصميمه بشكل هادف ، إلا أنه من المعروف أن الفعالية العلاجية العالية لبعض الأدوية الأقدم والأكثر قيمة ترجع إلى تفاعلها مع أهداف متعددة تسبب تأثيرات مفيدة تآزرية .

10،11 تم العثور على ملفات تعريف النشاط متعدد الاتجاهات للعقاقير المعروفة مصادفة ، أو حتى غير معروفين. 

يعمل اكتشاف الأدوية الحديث على تغيير استراتيجيته تدريجيًا ويبدأ في الشروع في نهج متعددة الأهداف .

12،13 وهذا أيضًا أساس برامج فحص الأدوية والتنبؤ الحسابي على نطاق واسع ، وكلاهما مطبق بالفعل على COVID-19 والعديد من الأدوية لديها تم التعرف عليه مؤخرًا مع نشاط مضاد لـ SARS-CoV-2 في المختبر

هنا قمنا بتطبيق نهج تنبؤ حسابي جديد يعتمد على استراتيجية قائمة على المسار الكيميائي الحيوي.

 إن مفتاح استراتيجيتنا هو الفرضية المتعددة الدوائية ، وهي أن الأدوية تتفاعل وتتداخل في وقت واحد مع العديد من الأهداف وبالتالي تعيد توصيل شبكات المسارات الكيميائية الحيوية.

 وبالتالي يتم تحديد مشكلة تحديد الدواء من خلال إيجاد دواء يتطابق مع ملف تعريف تعديل المسار المحدد مسبقًا. 

نقطة البداية في نهجنا هي وصف شانون القائم على الانتروبيا للسمات الكيميائية المتأصلة للجزيئات الصغيرة (الأدوية) مع نشاط مثبت ضد SARS-CoV-2 والآثار المترتبة على خصوصية هدف البروتين.

 باستخدام هذا الوصف الفريد ، من الممكن تحديد أوجه التشابه المخفية وغير المتوقعة بين الأدوية وتحديد أهداف بروتينية جديدة تشارك في المسارات الكيميائية الحيوية الأساسية.

حدد نهج التنبؤ هذا عائلات الأدوية والأدوية المعتمدة ، وبعضها له نشاط مثبت ضد SARS-CoV-2 أو فعالية إكلينيكية.

 تسلط نتائجنا الضوء على دور مضادات الهيستامين كفئة أدوية واعدة لمكافحة COVID-19. 

الأهم من ذلك ، أننا نقدم دليلاً على أن أزيلاستين مانع مستقبلات الهيستامين 1 (H1) ، المستخدم على نطاق واسع في علاج التهاب الأنف التحسسي في تركيبة بخاخ الأنف ، فعال ضد عدوى السارس- CoV-2.

طرق

طريقة حسابية لتحديد أدوية COVID-19 المفترضة

تعتمد استراتيجية التحديد الموصوفة هنا على الفرضية القائلة بأن الأدوية التي تحتوي على مسارات (نشاط) كيميائية حيوية مماثلة ستعالج مناطق مرض مماثلة.

 اعتمد نهجنا الحسابي على مفهوم Shannon-Entropy Descriptor (SHED) حيث يتم تحويل التركيب الكيميائي إلى رسم بياني طوبولوجي ثنائي الأبعاد حيث تتوافق 

العقد مع الذرات في الدواء وتشير الحواف التي تربط بين عقدتين إلى وجود رابطة كيميائية. 

الميزة الأكثر أهمية لنهج SHED هي أن الجزيئات التي تبدو مختلفة مع بنى جزيئية ثنائية الأبعاد مختلفة بشكل كبير يمكن أن يكون لها مع ذلك نواقل إنتروبيا شانون متشابهة مما يؤدي إلى أنماط نشاط كيميائية حيوية (دوائية) مماثلة.

 ترد تفاصيل النهج الحسابي في المادة التكميلية 1.

كانت نقطة البداية في استراتيجية البحث الخاصة بنا هي اختيار ملف تعريف المسار المرغوب والبحث اللاحق عن الأدوية المعتمدة إكلينيكيًا التي تتطابق مع نمط النشاط المحدد مسبقًا (الشكل 1).

 كانت المعلومات التجريبية ذات الصلة متاحة من تحليل حديث لمسارات KEGG المتضمنة في عدوى SARS-CoV-2. 

ثانيًا ، استخدمنا معلومات المسار التي توقعناها للأدوية التي ثبت أنها نشطة ضد SARS-CoV و / أو SARS-CoV-2.

 ثلاثة مركبات تم التحقق منها تجريبياً ومميزة ، هيدروكسي كلوروكوين 17 ، SSAA09E2 {N - [[4- (4-methylpiperazin-1-yl) phenyl] methyl] 

-1،2-oxazole-5-carboxamide} و SSAA09E3 {N- (9، تم استخدام 10-dioxo-9،10-dihydroanthracen-2-yl) benzamide} 18. 

يقلل Hydroxychloroquine من التحمض الداخلي ، ويعمل SSAA09E2 عن طريق منع التفاعلات المبكرة لـ SARS-CoV مع مستقبلاته ، 

الإنزيم المحول للأنجيوتنسين 2 (ACE2) ، الذي يشاركه SARS-CoV-2 و SSAA09E3 يمنع اندماج الغشاء الفيروسي مع الغشاء الخلوي المضيف. 

بالنسبة لجميع الروابط الثلاثة المحددة ، تم حساب ملفات تعريف المسار ، وتم أخذ أعلى 50 مسارًا في الاعتبار للتحليل.

شكل 1.

مخطط تخطيطي لنهج التنبؤ بالعقاقير.

ج: رسم توضيحي للخطوة الأولى: 

نهج شانون الأنتروبيا لوصف الجزيئات الصغيرة. 

يتم تحويل التركيب الجزيئي ثنائي الأبعاد إلى رسم بياني طوبولوجي (شبكة) حيث تُنسب كل ذرة (عقدة) بنوع ذري (ميزة).

 يتم حساب أقصر طول مسار لكل زوج ذرة (زوج من الميزات). 

يتم تحويل أقصر توزيع طول مسار N (q) لزوج ميزة معين (i) إلى احتمال p (q) يتم من خلاله حساب إنتروبيا شانون Si. 

وبالتالي ، فإن واصف الانتروبيا شانون SHED للجزيء هو متجه S شانون للإنتروبيا الذي يشتمل على قيم إنتروبيا لأزواج الميزات الفردية.

 ب: رسم توضيحي للخطوة الثانية: 

التنبؤ المستند إلى SHED لملفات المسار. 

يتم استخدام متجه إنتروبيا شانون للجزيء لفحص قاعدة بيانات DrugBank لنظائر SHED.

 يتم تصنيف نظائر DrugBank وفقًا لأوجه تشابه SHED المزدوجة مع جزيء الاستعلام. 

تُستخدم أهداف البروتين ومسارات KEGG المقابلة لإدخالات DrugBank الفردية للتنبؤ بملف مسار جزيء الاستعلام (معظم المسارات السائدة / ذات الصلة موضحة باللون الأحمر).

مقايسة عدوى SARS-CoV-2 بخط خلية VERO E6

تم زرع خلايا Vero E6 (الخلايا الظهارية لكلية قرد أفريقي أخضر) (ATCC CRL-1586) على 96 طبقًا جيدًا عند 4.5 104 / بئر واستخدمت عند التقاء 90 ٪ تقريبًا. 

تم استخدام Azelastine-HCl (SeleckChem ، S2552) بتركيزات تتراوح من 0 ·4 إلى 25 ميكرومتر.

 في وضع وقائي ، مباشرة بعد إضافة azelastine في وسط الثقافة ، 

أصيبت الخلايا بـ SARS-CoV-2 (hCoV-19 / Hungary / SRC_isolate_2 / 2020 ،

. بعد 30 دقيقة من الحضانة في جو رطب بنسبة 5٪ من ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية ،

 تمت إزالة وسط الاستزراع واستبداله بوسط زراعة جديد يحتوي على أزيلاستين بتركيزات معينة. 

في بيئة علاج ما بعد العدوى ، أصيبت الخلايا لمدة 30 دقيقة بدون أزيلاستين ، ثم تمت إزالة وسط الزراعة المحتوي على الفيروس ، 

واستبداله بوسط جديد مع أزيلاستين. 

بعد 48 ساعة من الإصابة ، تم تقييم التأثير الممرض للخلايا عن طريق الملاحظة المجهرية وتم جمع المواد الطافية لتقدير عدد نسخ الحمض النووي الريبي الفيروسي. 

تم تقييم تأثير الاعتلال الخلوي بشكل شبه كمي بناءً على درجات اعتلال الخلايا (CPS) التي تتراوح من 0 إلى 4 ؛ 0: 

لا يوجد تأثير اعتلال خلوي ، يمكن مقارنته بالسيطرة غير المصابة ، 

4: CPE قوي كما هو الحال في السيطرة المصابة. استند تأثير الاعتلال الخلوي على ظهور "ثقوب" في الطبقة المتجانسة والمتجانسة من الخلايا التي تشير إلى موت الخلية.

 تم تحديد قابلية بقاء الخلية في وجود الأدوية (بدون عدوى) بناءً على محتوى ATP الخلوي باستخدام اختبار 

اختبار النشاط المضاد لـ SARS-CoV-2 لأزيلاستين الذي يحتوي على رذاذ أنفي مع نسيج أنف بشري معاد تكوينه

أُصيب نسيج الأنف البشري MucilAir ™ الناتج من متبرعين أصحاء (Epithelix ، Cat #: EP02MP) بفيروس SARS-CoV-2 في وزارة الداخلية في 0 01 على الجانب القمي.

 بعد 20 دقيقة من الحضانة عند 37 درجة مئوية في 5٪ من ثاني أكسيد الكربون ، تمت إزالة الفيروس المحتوي على الوسائط تمامًا. 

تمت إضافة محلول مخفف 5 مرات (في وسط استنبات MucilAir ™) من رذاذ الأنف Allergodil (0 · 1٪ azelastine ، Mylan) على الجانب القمي (200 ميكرولتر) لمدة 20 دقيقة.

 بعد العلاج ، تمت إزالة رذاذ الأنف المخفف بالكامل من سطح الخلايا لتوفير واجهة هواء سائلة واحتضانها لمدة 24 ساعة. 

تم تكرار العلاج لمدة 20 دقيقة مع Allergodil المخفف في 24 و 48 ساعة بعد الإصابة (hpi).

 بعد 24 و 48 و 72 بوصة في البوصة ، تم غسل الجوانب القمية للخلايا لمدة 15 دقيقة باستخدام وسيط MucilAir ™ Culture ، وتم جمع المحلول لتحديد رقم نسخة RNA الفيروسي. تم فحص الخلايا أيضًا تحت مجهر مقلوب بسرعة 48 و 72 حصانًا في البوصة.

تقدير كمية الفيروس باستخدام تحليل Droplet digitalPCR

تم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي من 100 ميكرولتر من مادة طافية أو يغسل قمي باستخدام مجموعة Monarch® Total RNA Miniprep Kit (Promega ، Cat #: T2010S).

 بالنسبة لعدد النسخ الفيروسي ، تم تطبيق تقنية PCR الرقمية (Bio-Rad Laboratories Inc. QX200 Droplet Digital PCR System).

 كانت الاشعال والتحقيقات المستخدمة خاصة بجين SARS-CoV-2 RdRp (التمهيدي العكسي:

 CARATGTTAAASACACTATTAGCATA ، التمهيدي الأمامي: 

GTGARATGGTCATGTGTGGCGG ، المسبار: 

FAM-CAGGTGGAACCTCATCAGGAGATGC-BBQ). بالنسبة لجميع التركيزات ، تم تحضير ثلاث مكررات على الأقل وتم تحديد قيم EC50 باستخدام الانحدار غير الخطي (السجل (المانع) مقابل الاستجابة - الانحدار المتغير (أربعة معلمات)) باستخدام GraphPad Prism 8.4.3 

تم إجراء تجارب مع SARS-CoV-2 المعدية في مرفق BSL4 التابع لمركز 

Szentágothai للأبحاث ، جامعة Pécs ، المجر

النتائج

تعريف ملامح مسار الاستعلام لإعادة توظيف الأدوية

وجدنا تداخلًا كبيرًا بين مسارات KEGG الثلاثة المتوقعة والتجريبية (المادة التكميلية 2 والشكل 2 أ). 

كان أبرزها التداخل بين مسارات SSAA09E2 و Hydroxychloroquine (34 من أفضل 50 نتيجة). 

تم تصوير 9 من أصل 50 مسارًا في جميع مجموعات التنبؤ الثلاثة ، وتم وصف أربعة منها أيضًا في مجموعة البيانات التجريبية التي نشرها Zhou et al.

 تم وصف 12 مسارًا من 95 مسارًا فريدًا في المجموعات الثلاث المتوقعة بشكل تجريبي أيضًا ( الشكل 2 ، المادة التكميلية 2). 

كانت مناطق المرض الأكثر شيوعًا المرتبطة بالمسارات المتوقعة هي الأمراض المعدية: 

العدوى الفيروسية (مثل الحصبة والتهاب الكبد الوبائي C و EBV والأنفلونزا و HSV) والالتهابات الطفيلية (مثل شاغاس وداء الليشمانيات وداء المثقبيات والملاريا) والالتهابات البكتيرية (مثل السل ، السالمونيلا ، الشيغيلا ، الشاهوق ، ETEC) أو 

العمليات الخلوية المتضمنة أثناء العدوى (مثل الالتقام الخلوي ، إشارات الخلايا المناعية) (المادة التكميلية 2).

الشكل 2.

إعادة تحديد الغرض من العقاقير القائمة على المسار والتداخل بين ثلاثة مجموعة بيانات مسار متوقعة وتم التحقق منها تجريبياً.

(أ) رسم توضيحي لإعادة توظيف الأدوية القائمة على المسار. 

يتم فحص ملف تعريف المسار المحدد مسبقًا الذي تم الحصول عليه لعقار استعلام (موضح في الشكل 1) مقابل مجموعة بيانات من عقاقير القوالب مع ملفات تعريف مسار محسوبة مسبقًا (على سبيل المثال ، الأدوية المعتمدة سريريًا). 

يتم الحصول على الأدوية المثيرة للاهتمام ذات الصلة بتطبيقات إعادة الاستخدام من خلال تعظيم تداخل المسار. 

(ب) تم تحديد المسارات التي يُتوقع أن تكون متورطة في عدوى SARS-CoV-2 باستخدام ثلاثة أدوية ثبت أنها نشطة ضد SARS-CoV:

 مثبط ارتباط مستقبلات الفيروسات: SSAA09E2 ، مثبط اندماج الغشاء الفيروسي والخلوي: 

SSAA09E3 وهيدروكسي كلوروكوين. تشير الأرقام المكتوبة بخط عريض وأقواس إلى عدد المسارات التي تم اكتشافها أيضًا في مجموعة بيانات تجريبية بواسطة Zhou وآخرون. 

16 مسارات KEGG المشاركة في هذا التحليل موضحة في المادة التكميلية 2.

فحص الأدوية من أجل مطابقة المسارات

بعد ذلك ، تم فحص مجموعة من 2700 دواء - تم اختبارها إكلينيكيًا ، ومعظمها معتمد ومتاح تجاريًا عبر SELLECKCHEM - بحثًا عن مسارات مطابقة.

 تم تخزين النتائج التي تم تحديدها كقائمة مرتبة وتم تصنيفها بناءً على عدد المسارات المشتركة (تم فحصها باستخدام أفضل 50 مسارًا للتسجيل). 

تم التنبؤ بأعلى 100 دواء في أربع شاشات مستقلة باستخدام مثبط ارتباط مستقبلات الفيروسات SSAA09E2 (A) ، و hydoxychloroquine (B) ، ومثبط اندماج 

الغشاء SSAA09E3 (C) والمسارات التجريبية المحددة لـ SARS-CoV-2 16 (D ) لمزيد من التحليل وتم تقديمها في المادة التكميلية 3 (سرد الأدوية المحددة في شاشتين على الأقل وفي فئات الأدوية الرئيسية). 

التداخل بين مجموعات الأدوية المتوقعة يتماشى مع المسارات المتوقعة المقابلة. 

ما يقرب من نصف الأدوية التي تم التنبؤ بها بناءً على مسارات SSAA09E2 أو hydoxychloroquine (التي تظهر تقريبًا 2/3 تداخل) كانت متطابقة (الشكل 3).

كانت فئات الأدوية الرئيسية هي مضادات العدوى (مضادات الفيروسات ، المضادات الحيوية ، مضادات الفطريات) ،

 مضادات الهيستامين ، الأدوية المضادة للالتهابات (غير المنشطات) ، الأدوية الخافضة للضغط ، مدرات البول (حاصرات قنوات البوتاسيوم) ، 

المسكنات والأدوية ذات التأثير العصبي (بشكل رئيسي مضادات- الذهان) (مادة تكميلية 3). 

تمت مشاركة ما يقرب من 30٪ من الأدوية المحددة في مجموعتي البيانات A و B مع تلك المشتقة من المسارات من مجموعة بيانات SARS-CoV-2 التجريبية (D) (21 من 74 ، الشكل 3). 

وجدنا أيضًا تداخلًا دوائيًا كبيرًا (حوالي 30 ٪) بين مجموعات البيانات التي تم الحصول عليها لمثبط الاندماج الفيروسي SSAA09E3 ومسارات SARS-CoV-2 التجريبية. 

هنا ، سيطرت المنشطات بجميع أنواعها على الأدوية المتداخلة (الجلوكوكورتيكويدات المضادة للالتهابات ، نظائر البروجسترون).

الشكل 3.

التداخل بين الأدوية التي تم تحديدها بواسطة مجموعات المسارات المختلفة المتوقع أن تشارك في عدوى SARS-CoV-2.

تم استخدام المسارات ذات الصلة بعدوى SARS-CoV-2 التي يُتوقع أن تتأثر بثلاثة عقاقير مختارة لتحديد الأدوية من DrugBank.

 يتم عرض الأدوية المتنبأ بها المتضمنة في هذا التحليل في المادة التكميلية 3

كانت مضادات الهيستامين من بين الأدوية الأكثر انتشارًا ، حاصرات مستقبلات H1 و H2. 

تم توقع الطب المضاد للحساسية H1-blocker ، azelastine ، في ثلاث شاشات مستقلة (المادة التكميلية 3). 

نظرًا لأن الأزيلاستين ليس له تأثير كبير على وظائف الأعضاء الطبيعية أو فيما يتعلق بالأعراض الجانبية ، فقد كان في بؤرة المزيد من الدراسات.

لقد توقعنا أن تشارك الجينات في عمل أزيلاستين وهيدروكسي كلوروكين ووجدنا أن ما يقرب من ثلثي الجينات التي تم الحصول عليها باستخدام أزيلاستين تتداخل مع تلك المحددة مع هيدروكسي كلوروكين ،

 وكانت مرتبطة بشكل أساسي بالاستجابة المناعية ، والتي تتماشى مع التأثيرات المضادة للالتهابات من هذين المركبين ، اللذين ورد ذكرهما في الأدبيات (المادة التكميلية 4) .

19،5 ومع ذلك ، وجدنا أيضًا اختلافات كبيرة في مجموعتي الجينات التي تدل على آليات خلوية متميزة قد تؤدي إلى تأثيرات مضادة للفيروسات (المادة التكميلية 4).

نشاط مضاد لـ SARS-CoV-2 لأزيلاستين في خط خلايا Vero E6

تم اختبار Azelastine لأول مرة من أجل التأثير المضاد للفيروسات في مقايسة قياسية ذهبية لعدوى SARS-CoV-2 باستخدام ACE2 معربًا عن خلايا Vero E6 (ظهارية الكلى القرد الأخضر الأفريقي) في نطاق تركيز 0 · 4 و 25 ميكرومتر ، إما مع co- 

تناول الفيروس أو كعلاج بعد عدوى فيروسية. 

بناءً على تقييم نصف كمي عن طريق الفحص المجهري للخلايا بعد 48 ساعة من الإصابة ، كان azelastine فعالًا في تقليل تأثير اعتلال الخلايا في نطاق تركيز 3 إلى 25 ميكرومتر (الشكل التكميلي 1). 

كانت قيم EC50 للتأثيرات المضادة للفيروسات المستندة إلى التقدير الكمي للفيروس من المادة الطافية للثقافة حوالي 6 ميكرومتر لكل من الإدارة المشتركة وإعدادات العلاج (الشكل 4 أ ب).

الشكل S1.

الوقاية من تأثير السارس-CoV-2 الناجم عن الاعتلال الخلوي بواسطة أزيلاستين.

أصيبت خلايا Vero E6 بـ SARS-CoV-2 في وقت واحد مع إضافة 0 ·4 إلى 25 ميكرومتر من أزيلاستين واستمر زرعها بدون الفيروس في وجود تركيزات كل منها من الأدوية. 

تم تقييم تأثير الاعتلال الخلوي عن طريق الفحص المجهري للمجال الضوئي للثقافات بعد 48 ساعة من الإصابة. A: غير مصاب (سلبي) السيطرة ،

 B: الفيروس المصاب (إيجابي) السيطرة ، C: الفيروس + 3 · 125 ميكرومتر أزيلاستين ، D: فيروس + 6 · 25 ميكرومتر أزيلاستين ، E: فيروس + 12 · 5 ميكرومتر أزيلاستين ، F: فيروس + 25 ميكرومتر أزيلاستين.

 G: نظام التسجيل وملخص للتأثير الخلوي في وجود أزيلاستين (نتائج تجربتين مستقلتين)

الشكل 4.

Azelastine فعال ضد عدوى SARS-CoV-2 في خط خلايا Vero E6.

ج: أصيبت خلايا Vero E6 بـ SARS-CoV-2 في وقت واحد مع إضافة 0.4 إلى 25 ميكرومتر من أزيلاستين وبعد 30 دقيقة استمر استزراعها بدون الفيروس في وجود تركيزات كل من الدواء.

 ب: أصيبت الخلايا بـ SARS-CoV-2 لمدة 30 دقيقة ، ثم تمت إزالة الفيروس عن طريق الغسل وتم استبدال وسط الاستزراع إلى وسط يحتوي على 04 إلى 25 ميكرومتر من أزيلاستين. 

بعد 48 ساعة ، تم استخلاص الحمض النووي الريبي من المادة الطافية للثقافة وتم قياسه عن طريق تحليل PCR الرقمي للقطيرات. 

تم تحديد قابلية بقاء الخلية في المزارع الضابطة بدون عدوى فيروسية تمت معالجتها بالأزيلاستين. تظهر الرسوم البيانية يعني ± SEM من 5 مكررات بيولوجية و 2 مكررات تقنية من عينات مختارة. 

تم حساب قيم EC50 باستخدام برنامج GraphPad Prism 8.4.3.

نشاط مضاد لـ SARS-CoV-2 لأزيلاستين يحتوي على رذاذ أنفي باستخدام نسيج أنف بشري معاد تكوينه

نظرًا لاستخدام الأزيلاستين على نطاق واسع في بخاخات الأنف المضادة للحساسية ، فقد اختبرنا أحد المنتجات المتاحة تجاريًا على أنسجة أنف بشرية ثلاثية الأبعاد معاد تكوينها (MucilAir ™). 

تم إصابة عينات الأنسجة أولاً بالفيروس ثم عولجت بخمسة أضعاف من محلول بخاخ أنف مخفف بنسبة 0 1٪ لمدة 20 دقيقة كل 24 ساعة لمدة ثلاثة أيام. أظهر التحليل المجهري للأنسجة في 48 و 72 ساعة انخفاض إنتاج الميوسين في الخلايا المصابة 

مقارنة بالخلايا الضابطة (لا يوجد فيروس أو علاج دوائي) التي تم حفظها في وجود أزيلاستين (الشكل 5). 

لم يتم الكشف عن أي اختلاف في شكل الأنسجة في السيطرة والخلايا المعالجة بالأزيلاستين (بدون عدوى فيروسية) كما تم الكشف عن حركة الأهداب (البيانات غير معروضة).

الشكل 5.

يمنع Azelastine تكاثر الفيروس في أنسجة الأنف البشرية المصابة بفيروس SARS-CoV-2.

أصيب أنسجة الأنف البشرية MucilAir ™ بـ SARS-CoV-2 وعولجت بعد ذلك بخمسة أضعاف بمحلول بخاخ للأنف يحتوي على 1٪ أزيلاستين لمدة 20 دقيقة كل 24 ساعة لمدة ثلاثة أيام. 

صور مجهرية منخفضة الدقة للثقافات بعد 48 و 72 ساعة من العلاج.

أكد تحليل Droplet Digital PCR وجود عدوى فعالة لـ SARS-CoV-2 وتكاثر سريع للفيروس ، حيث وصل إلى عدة آلاف من النسخ لكل ميكروليتر بعد 72 ساعة من الإصابة في المقصورة القمية لإدخالات الأنسجة (الجدول 1). 

أدى العلاج اليومي لمدة 20 دقيقة بالأزيلاستين (0 · 02٪) إلى خفض أعداد الجسيمات الفيروسية بشكل كبير (> 99 · 9٪ تثبيط) بمقدار 48 و 72 ساعة بعد الإصابة (الجدول 1).

الجدول 1.

أرقام نسخ الحمض النووي الريبي الفيروسي في أنسجة الأنف غير المعالجة والمعالجة بالأزيلاستين.

نقاش

تم تحديده من خلال التنبؤ الحسابي وتم تأكيده من خلال الاختبارات التجريبية في المختبر ، وحددنا أزيلاستين ، وهو مركب مضاد للحساسية ، ومتوفر على نطاق واسع في تركيبة الأنف كعلاج محتمل لمكافحة COVID-19.

لقد اتبعنا نهجًا لإعادة تحديد الغرض من الدواء يتمحور حول المسار للتنبؤ بالعقاقير ذات النشاط المحتمل لمكافحة COVID-19. 

في مفهومنا متعدد الأدوية ، يعتمد أسلوب عمل الدواء على توزيع أهداف البروتين والمسارات البيوكيميائية التي تشكل جزءًا منها. 

نحن نجادل في أن هذا نهج واعد أكثر مقارنة باستراتيجيات تصميم العقاقير الفردية المستهدفة التقليدية ، لا سيما في ضوء النمط الظاهري للمرض متعدد العوامل لـ COVID-19.

قمنا بفحص قاعدة بيانات DrugBank بثلاثة جزيئات صغيرة مع نشاط مثبت لـ SARS-CoV أو SARS-CoV-2 لتحديد العقاقير ذات نواقل الانتروبيا المماثلة لـ Shannon ، 

ثم استخدمنا المعلومات حول المسارات التي يُتوقع تنشيط هذه الأدوية. 

لوحظ التداخل الأكبر مع المسارات المعروفة بتورطها في الالتهابات البكتيرية والطفيلية والفيروسية والعمليات الخلوية المرتبطة بالأمراض المعدية. 

باستخدام ملفات تعريف المسار المتوقعة الثلاثة وواحد 16 تجريبيًا ، حددنا 263 عقارًا ، مع ظهور 117 في أكثر من شاشة واحدة. 

كانت فئات الأدوية الرئيسية هي مضادات العدوى (مضادات الفيروسات والمضادات الحيوية ومضادات الفطريات) ومضادات الهيستامين والعقاقير المضادة للالتهابات 

(مركبات غير المنشطات) والأدوية المضادة لارتفاع ضغط الدم والأدوية التي تستهدف الجهاز العصبي المركزي ، وخاصة مضادات الذهان.

ومن المثير للاهتمام أننا وجدنا بعض التداخل مع الأدوية التي تنبأ بها نهج الشبكة المعقدة الذي أبلغت عنه مجموعة Barabási ، 

والذي يعتمد على معلومات حول شركاء ربط البروتين البشري حيث من المحتمل أن يزعج المرشحون المحتملون للأدوية الشبكة التفاعلية ذات الصلة بالعدوى الفيروسية 15. على الرغم من أن منهجيتنا تراعي مسارات كيميائية حيوية مستقلة عن أحداث تفاعل البروتين الفردي ، 

تم أيضًا تحديد 15 من 81 من أفضل الأدوية التي حصلت على الدرجات والأولوية من تلك الدراسة في شاشاتنا.

يتم التحقيق في العديد من الأدوية المتوقعة من هذه الدراسة للتأكد من فعاليتها في الدراسات السريرية. 

والجدير بالذكر أن الديكساميثازون قد أثبت قدرته على تقليل معدل وفيات مرضى COVID-19 الذين يخضعون للتهوية الميكانيكية بمقدار الثلث.

 2 تم توقع عقارين إضافيين هنا ، فاموتيدين ، وهو مضاد للهيستامين مانع لـ H2 يستخدم لتقليل إنتاج حمض المعدة وتيلميسارتان ،

 وهو مستقبل الأنجيوتنسين.

 تم الإبلاغ مؤخرًا عن عقار مانع لارتفاع ضغط الدم يحسن معدلات الاعتلال لدى المرضى في المستشفى المصابين بـ SARS-CoV-2.21،22 ،

 ويتم اختبار مثبط إنزيم سيرين بروتياز الاصطناعية نافاموستات ميسيلات ، المعتمد لالتهاب البنكرياس ويستخدم أيضًا كمضاد تخثر سريع المفعول ،

 من أجل فعاليته ضد COVID-19.23 يفسر نشاطه المضاد لـ SARS-CoV-2 من خلال تثبيط سيرين بروتياز المرتبط بغشاء البلازما ، TMPRSS2 ، 

والذي يستخدمه الفيروس لتقسيم وتفعيل بروتين سبايك المطلوب لدخول الفيروس في الظهارة الرئوية أثبتت Nafamostat فعاليتها في المختبر أكثر من مثبطات الأنزيم البروتيني السيرين الأخرى ، camostat ، التي تم اختبارها أيضًا سريريًا .23

ثبت أن العديد من الأدوية المتوقعة في هذه الدراسة لها نشاط ضد فيروسات كورونا في المختبر. 

تم تحديد Cepharanthine ، وهو مركب طبيعي يحتوي على أنشطة مضادة للالتهابات ومضادة للأورام ، في مشروع إعادة استخدام عقار COVID-19 عالي الإنتاجية حديثًا على نطاق واسع باستخدام مكتبات من عقار 3000 (∼1000 من هذه الأدوية المعتمدة من قِبل إدارة الأغذية والعقاقير) 8 وأيضًا بواسطة آخرين .

24،25 أظهرت الدراسات السابقة آثاره المثبطة على كل من SARS-CoV 26 و HCoV-OC43.27 تم تحديد Clofazimine ، وهو مضاد حيوي يستخدم ضد الجذام كأحد الأدوية الفعالة الـ 21 ضد SARS-CoV-2 (التي قللت من تكاثر الفيروس 

بواسطة 40٪ على الأقل وأظهرت استجابة للجرعة) تم اختيارها في جهد فحص واسع النطاق مع 12000 مرحلة سريرية أو جزيئات صغيرة معتمدة من إدارة الغذاء والدواء .14

من الأدوية المتوقعة ذات النشاط غير المثبت ضد السارس-CoV-2 ، ركزنا على الأزيلاستين (اختبار الأدوية الأخرى مستمر). 

كان هذا الاختيار مدفوعًا بما يلي: 

1. ، المظهر الجانبي المناسب للآثار الجانبية ، الجيل الثاني غير المهدئ في معظم الأفراد ، 

2. لا يوجد تأثير كبير على علم وظائف الأعضاء الطبيعي ، حيث أن الدلالة تهدف إلى تخفيف أعراض الحساسية ،

 3. ، التوافر الواسع ، استخدام واسع ، تكلفة منخفضة ؛ 

4. ، توافر تركيبة الأنف للتأثير المحتمل على استعمار الأنف ؛

 5. ، العديد من حاصرات H1 و H2 المحددة في شاشاتنا وغيرها ، على سبيل المثال إيباستين 8،28 ؛ و 6. ، بيانات سريرية إيجابية مع فاموتيدين مضادات مستقبلات H2

نقدم هنا دليلًا تجريبيًا على أن الأزيلاستين فعال ضد عدوى SARS-CoV-2 في نظام الفحص المختبري الأكثر استخدامًا مع خلايا Vero E6 مع قيمة EC50 قابلة للمقارنة (∼6 ميكرومتر) محددة لكلوروكين ، 

لوبينافير ، وريمديسفير (7 إلى 11 μM) باستخدام نفس خط الخلية. 

25 تثير خيبة الأمل الكبيرة مع الكلوروكين / هيدروكسي كلوروكين في دراسات الفعالية السريرية القلق بشأن القيمة التنبؤية لهذه النتائج في المختبر. 

كشفت البيانات الحديثة أن اختيار الخلايا في مقايسة عدوى SARS-CoV-2 له تأثير كبير على نتيجة اختبار تغيير الغرض من الأدوية وأظهرت أن هيدروكسي كلوروكين لم يكن نشطًا ضد الفيروس في الخلايا الظهارية التنفسية البشرية. 

من التحمض الداخلي ، فإن طريقة عمل هيدروكسي كلوروكين ليست ذات صلة بالخلايا الظهارية التنفسية.

بناءً على تحليل مصطلح GO والجينات المتوقعة المعنية ، من المرجح أن يستغل الأزيلاستين عمليات بيولوجية مختلفة مقارنةً بهيدروكسي كلوروكوين. 

لم يتم تحديد الآلية الجزيئية الدقيقة لتأثيره المضاد للفيروسات حاليًا وتحتاج إلى مزيد من الاستكشاف العلمي.

الأهم من ذلك ، لقد أكدنا فعالية الأزيلاستين في الخلايا الظهارية التنفسية البشرية باستخدام نموذج مختبري وثيق الصلة ، وهو النسيج الأنفي البشري المعاد تشكيله.

 في هذا النموذج ، قمنا بمحاكاة الوضع السريري لاستعمار الأنف بواسطة SARS-CoV-2 ولاحظنا التوقف الكامل للتكاثر الفيروسي حتى بعد العلاج الأول لمدة 20 دقيقة باستخدام محلول بخاخ للأنف تجاري مخفف يحتوي على أزيلاستين بخمسة أضعاف.

أزيلاستين دواء متعدد الأوجه. 

يُعرف باسم مانع مستقبلات الهيستامين H1 ، الذي لا يعمل كمضاد ولكن كمنبه عكسي ، مما يقلل من النشاط التكويني لمستقبل H1. 

ومع ذلك ، فإن للأزيلاستين أيضًا تأثيرات عامة مضادة للالتهابات ، يتم إجراؤها بشكل أساسي عن طريق تثبيت الخلايا البدينة وتثبيط الليكوترين و إنتاج السيتوكينات المؤيدة للالتهابات .

19 الأهم من ذلك ، الخلايا البدينة هي المصادر الرئيسية لإطلاق السيتوكين الذي يؤدي إلى تلف الرئة في SARS-CoV-2 وقد تم التكهن بأن مثبتات الخلايا البدينة قد تخفف أيضًا من المضاعفات الرئوية والالتهابات المميتة والموت في COVID -19

.29 لذلك ، من المتوقع أن تكون التأثيرات المفيدة المحتملة لأزيلاستين في COVID-19 مزيجًا من الإجراءات المضادة للفيروسات وتوسط المضيف. 

تدعم البيانات السريرية الحديثة مع فاموتيدين مناهض مستقبلات H2 الفوائد العلاجية المحتملة لمضادات الهيستامين في مرضى COVID-19.

إن التآزر بين حاصرات H1 والقشرانيات السكرية بسبب التفاعل بين مسارات تنشيط مستقبلات H1 والقشرانيات السكرية ، معروف سريريًا جيدًا ، وغالبًا ما يتم استخدام نوعي الأدوية معًا .

30 نظرًا للفعالية السريرية للديكساميثازون على COVID-19 المراضة والوفيات ، واختبار مضادات الهيستامين والمنشطات المضادة للالتهابات مجتمعة له ما يبرره بشدة.

يتمثل الأثر الرئيسي لنتائجنا في أن تركيبة بخاخ الأنف المتاحة على نطاق واسع والتي تحتوي على أزيلاستين قد تكون حلاً فوريًا لمنع وعلاج استعمار الأنف بفيروس SARS-CoV-2 ،

 وبالتالي قد يكون لها تأثير كبير على انتشار الفيروس داخل الشخص المصاب (الأنف إلى الرئة) وكذلك داخل السكان. هذه الإمكانية تحتاج إلى تأكيد في الدراسات السريرية.