فوائد حمض D- الأسبارتيك للرجال

  لقاح Ad26 يحمي من مرض السارس- CoV-2 السريري الحاد في الهامستر

نبذة مختصرة

غالبًا ما يكون مرض فيروس كورونا 2019 (COVID-19) لدى البشر مرضًا خفيفًا سريريًا ، لكن بعض الأفراد يصابون بالتهاب رئوي حاد وفشل تنفسي وموت 1،2،3،4. 

أفادت دراسات عدوى فيروس كورونا 2 (SARS-CoV-2) المتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة في الهامستر 5،6،7 والرئيسيات غير البشرية بشكل عام بمرض سريري خفيف ، وأظهرت دراسات لقاح السارس قبل الإكلينيكي انخفاضًا في الفيروس. 

تكرار في الجهاز التنفسي العلوي والسفلي في الرئيسيات غير البشرية.

 نوضح هنا أن جرعات عالية من عدوى السارس- CoV-2 داخل الأنف في الهامستر تؤدي إلى مرض سريري حاد ، بما في ذلك مستويات عالية من تكاثر الفيروس في الأنسجة ، والالتهاب الرئوي الواسع ، وفقدان الوزن والوفيات في مجموعة فرعية من الحيوانات. 

أدى التحصين الفردي بلقاح من النمط المصلي 26 الفيروسي الغدي الذي يعبر عن بروتين السارس- CoV-2 المستقر إلى استجابات الأجسام المضادة الملزمة والمعادلة ، وحمايته من فقدان الوزن والالتهاب الرئوي والوفيات الناجم عن السارس-CoV-2. 

توضح هذه البيانات الحماية من اللقاح ضد مرض SARS-CoV-2 الإكلينيكي. 

يجب أن يكون هذا النموذج مفيدًا للدراسات قبل السريرية للقاحات السارس-CoV-2 والعلاجات والتسبب في المرض.

الأساسية

يمكن أن يصيب SARS-CoV-2 الرئيسيات غير البشرية 8،9،10 ، الهامستر 5،6،7 ، ابن مقرض 14،15،16 ، hACE2 الفئران المعدلة وراثيًا 17،18 وأنواع أخرى ، لكن المرض السريري في هذه النماذج كان خفيفًا بشكل عام.

 قد يكون نموذج الالتهاب الرئوي الوخيم مفيدًا للتقييم قبل السريري للقاحات SARS-CoV-2 والتدابير المضادة الأخرى ، لأن عدوى SARS-CoV-2 في البشر يمكن أن تؤدي إلى مرض إكلينيكي شديد وفشل في الجهاز التنفسي والوفيات 1،2،3،4.

 قمنا بتقييم الخصائص السريرية والفيروسية لجرعة عالية من عدوى SARS-CoV-2 في الهامستر وقمنا بتقييم الفعالية الوقائية للقاح الفيروسي الغدي 26 (Ad26) المعتمد على الناقل 19 الذي يشفر ارتفاعًا مستقرًا لـ SARS-CoV-2 (S) في هذا نموذج صارم.

قمنا بتلقيح 20 هامسترًا ذهبيًا سوريًا (من 10 إلى 12 أسبوعًا) بجرعة 5 × 104 50٪ من زراعة الأنسجة (TCID50) (ن = 4 ؛ جرعة منخفضة) أو 5 × 105 TCID50 (ن = 16 ؛ جرعة عالية) سارس -CoV-2 عن طريق الأنف. 

في المجموعة ذات الجرعات العالية ، تم تشريح أربعة حيوانات في اليوم الثاني ، وتم تشريح أربعة حيوانات في اليوم الرابع للأحمال الفيروسية للأنسجة والتشريح المرضي ، وتم متابعة الحيوانات الثمانية المتبقية طوليًا. 

تم تشريح جميع الحيوانات المتبقية في اليوم الرابع عشر.

 في مجموعة الجرعات المنخفضة ، خسر الهامستر متوسط ​​14.7٪ من وزن الجسم بحلول اليوم السادس لكنه تعافى تمامًا بحلول اليوم 14 (الشكل 1 أ ، ب) ، بما يتفق مع الدراسات السابقة 5،6 ، 7. 

في المجموعة ذات الجرعات العالية ، خسر الهامستر في المتوسط ​​19.9٪ من وزن الجسم في اليوم السادس. 

من بين الحيوانات الثمانية في هذه المجموعة التي تم اتباعها طوليًا ، استوفت أربعة حيوانات معايير لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية للقتل الرحيم بأكثر من 20٪ من الوزن الفقد وضيق التنفس في اليوم السادس ، وحيوان آخران استوفيا هذه المعايير في اليوم السابع. 

تعافى الحيوانان المتبقيان بحلول اليوم الرابع عشر. 

توضح هذه البيانات أن جرعات عالية من عدوى السارس- CoV-2 في الهامستر أدت إلى فقدان شديد في الوزن وجزئي. معدل الوفيات.

الشكل 1: المرض السريري بعد الإصابة بـ SARS-CoV-2 في الهامستر.

شكل 1

أصيب الهامستر الذهبي السوري (10-12 أسبوعًا ؛ ذكور وإناث ؛ ن = 20) بـ 5 × 104 TCID50 (جرعة منخفضة ؛ ن = 4) أو 5 × 105 TCID50 (جرعة عالية ؛ ن = 16) من سارس -CoV-2 عن طريق الأنف. 

أ ، متوسط ​​الوزن بالنسبة المئوية للتغيير بعد التحدي.

 تعكس الأرقام عدد الحيوانات في كل نقطة زمنية. 

في المجموعة ذات الجرعات العالية ، تم تشريح أربعة حيوانات في اليوم الثاني ، وتم تشريح أربعة حيوانات في اليوم الرابع ، وامتثلت أربعة حيوانات لمعايير القتل الرحيم في اليوم السادس ، وتوافق حيوانان مع معايير القتل الرحيم في اليوم السابع.

 ب ، تغير الوزن النسبي بعد التحدي في الفرد الحيوانات. 

يتم تصوير متوسط ​​فقدان الوزن باللون الأحمر.

 تشير العلامات النجمية إلى معدل الوفيات. 

تشير الخطوط الرمادية إلى الحيوانات ذات التشريح المجدول في اليوم 2 واليوم 4. ج ، الأحمال الفيروسية للأنسجة كما تم قياسها بواسطة لوغ 10 نسخ من الحمض النووي الريبي لكل غرام من الأنسجة (حد القياس الكمي ، 100 نسخة لكل جرام) في التشريح المجدول في اليوم 2 واليوم 4 و في 2-5 من 6 حيوانات استوفت معايير القتل الرحيم في الأيام 6-7. لم يتم حصاد الأنسجة الممتدة في اليوم السادس.

تم تقييم الأحمال الفيروسية للأنسجة في الحيوانات الأربعة التي تلقت جرعات عالية من SARS-CoV-2 وتم تشريحها في اليوم الثاني ، وهي الحيوانات الأربعة التي تم تشريحها في اليوم الرابع والخامس من ستة من الحيوانات التي استوفت معايير القتل الرحيم في الأيام 6– 7 (الشكل 1 ج). 

تمت ملاحظة حمولات فيروسية عالية في الأنسجة في اليوم الثاني من 1012 نسخة من الحمض النووي الريبي لكل جرام في أنسجة الرئة و 108-109 نسخة من الحمض النووي الريبي لكل جرام في الفتحات والقصبة الهوائية ، بمتوسط ​​105-108 نسخة من الحمض النووي الريبي لكل جرام في القلب والجهاز الهضمي والدماغ والطحال والكبد والكلى ، مما يدل على انتشار العدوى.

 بحلول الأيام 6-7 ، كانت الأحمال الفيروسية للأنسجة أقل بمقدار 2 سجل ، على الرغم من استمرار فقدان الوزن.

تم تقييم جرذان الهامستر المصابة بجرعة عالية من SARS-CoV-2 بواسطة التشريح المرضي في الأيام 2 (ن = 4) ، 4 (ن = 4) ، 6-7 (ن = 6) و 14 (ن = 2).

 ارتبطت العدوى مع ارتشاح التهابي ملحوظ ونخر ظهاري متعدد البؤر للقرينة الأنفية (الشكل 2 أ) وظهارة القصبات الهوائية ، مما أدى إلى العدلات التنكسية والحطام الخلوي في التجويف (الشكل 2 ب). 

كانت البطانة للأوعية المجاورة تفاعلية مع التصاق الخلايا أحادية النواة بالبطانة وتنتقل داخل جدران الأوعية ، مما يدل على التهاب البطانة (الشكل 2 ب).

 كان هناك التهاب رئوي خلالي متعدد البؤر متوسط ​​إلى شديد يتميز بتوحيد رئوي يؤثر على 30-60٪ من حمة الرئة في وقت مبكر من اليوم الثاني بعد عدوى SARS-CoV-2 (الشكل 2 ج).

 وتتألف التسلل الالتهابي من أعداد هائلة من الضامة والعدلات مع عدد أقل من الخلايا الليمفاوية.

 كانت ظهارة المحارة الأنفية (الشكل 2 د) والخلايا الظهارية القصبية (الشكل 2 هـ) موجبة بشدة لبروتين القفصصة النووية السارس (SARS-CoV-N) عن طريق الكيمياء المناعية (IHC) في مناطق الالتهاب والنخر. 

أظهر SARS-CoV-N IHC أيضًا تلطيخًا محليًا واسع النطاق للحاجز السنخي والخلايا أحادية النواة الخلالية المتوافقة شكليًا مع الضامة (الشكل 2f).

 وبالمثل ، لوحظ وجود RNA الفيروسي SARS-CoV-2 (vRNA) في ظهارة القصبات الهوائية والنسيج الخلالي الرئوي في مناطق الالتهاب (الشكل 2g ، h).

الشكل 2: السمات المرضية لجرعة عالية من عدوى السارس- CoV-2 في الهامستر.

الشكل 2

أ

 ، النخر والالتهاب (السهم) في المحارة الأنفية ، H&E (اليوم 2).

 ب ، تنخر الظهارة القصبية مع الحطام الخلوي والعدلات التنكسية في التجويف (السهم) وتناسخ الخلايا الالتهابية في جدار الوعاء الدموي (رأس السهم) ، H&E (اليوم 2). 

ج ، الالتهاب الرئوي الخلالي ، نزيف وتوحيد حمة الرئة ، H&E (اليوم 2). 

د ، تُظهر ظهارة المحارة الأنفية إيجابية قوية لـ SARS-CoV-N بواسطة IHC (اليوم 2).

 تُظهر ظهارة القصبات الهوائية والحطام الخلوي اللمعي إيجابيًا قويًا لـ SARS-CoV-N بواسطة IHC (اليوم 2). 

تُظهر الخلايا الرئوية والحواجز السنخية إيجابية قوية متعددة البؤر لـ SARS-CoV-N بواسطة IHC (اليوم 2). 

g ، تلطيخ vRNA المنتشر بواسطة RNAscope داخل الخلالي الرئوي (السهم ، الالتهاب الرئوي الخلالي) وداخل الظهارة القصبية (رأس السهم ؛ اليوم 2). ح ، تلطيخ vRNA المنتشر بواسطة RNAscope داخل الخلالي الرئوي (اليوم 4). 

، Iba-1 IHC (الضامة) داخل الخلالي الرئوي (اليوم 7). 

j ، CD3 + T الليمفاوية داخل الخلالي الرئوي ، CD3 IHC (اليوم 4). 

ك ، MPO IHC تشير إلى وجود العدلات الخلالية (اليوم 7). 

l ، يظهر الجين المحرض للإنترفيرون MX1 IHC إيجابية قوية ومنتشرة في جميع أنحاء الرئة (اليوم 4). 

يتم عرض الأقسام التمثيلية. 

تم تكرار التجارب ثلاث مرات على الأقل مع نفس النتائج. أشرطة مقياس ، 20 ميكرومتر (ب ، د) ؛ 50 ميكرومتر (أ ، هـ ، و) ؛ و 100 ميكرومتر (ج ، ز –ل). H&E والهيماتوكسيلين ويوزين.

كانت مستويات كل من SARS-CoV-2 vRNA و SARS-CoV-N في الرئة أعلى في اليوم الثاني وتقلصت بحلول اليوم الرابع ، مع الحد الأدنى من بروتين vRNA و SARS-CoV-N الذي تم اكتشافه بحلول اليوم السابع (البيانات الموسعة الشكل 1). )

. تميز الالتهاب الرئوي بتسلل التهابي كبير لبروتين محول ربط الكالسيوم المتأين 1 (إيبا -1) + الضامة في النسيج الخلالي في الرئة بالإضافة إلى الخلايا الليمفاوية CD3 + T (الشكل 2 ط ، ي).

 تم الكشف عن العديد من العدلات القابلة للحياة والتنكسية في جميع أنحاء الرئة ، وخاصة في مناطق النخر ، مع ارتفاع نسبة التعبير عن العدلات النخاعي البيروكسيديز (MPO) في جميع أنحاء الرئة (الشكل 2 ك).

 تم الكشف أيضًا عن تعبير منتشر لمنتج الجين المحرض للإنترفيرون MX1 في الرئة (الشكل 2 لتر). 

على النقيض من حركية الكشف عن SARS-CoV-2 vRNA و SARS-CoV-N ، والتي بلغت ذروتها في اليوم الثاني ، بلغت علامات الالتهاب ذروتها في اليوم السابع (البيانات الموسعة الشكل 1) ، متزامنة مع الحد الأقصى من فقدان الوزن والوفيات ( الشكل 1 أ ، ب).

 لم يعكس اكتشاف vRNA في الرئة بواسطة RNAscope اللقاح الفيروسي فقط ، حيث اكتشفنا ليس فقط الحمض الريبي النووي الريبي السلبي المضاد للحس (الشكل 2 أ-هـ) ولكن أيضًا الحمض الريبي النووي الريبوزي الموجب (البيانات الموسعة الشكل 2 و-ي) ، والتي تداخلت في الموقع والنمط ، من اليوم الثاني إلى اليوم السابع بعد التحدي. 

كان تعبير SARS-CoV-2 vRNA (كلاهما مضاد للإحساس والإحساس) موجودًا في الرئة مع تعبير قوي لمستقبلات ACE2 (البيانات الموسعة الشكل 2 كيلو-س)

تم اكتشاف الحمض النووي الريبي الجهازي أيضًا في الأنسجة البعيدة ، بما في ذلك جذع الدماغ والجهاز الهضمي وعضلة القلب (البيانات الموسعة الشكل 3 أ-و). 

لوحظ التهاب بطانة الأوعية الدموية البارز والتهاب حول الأوعية الدموية مع الضامة والخلايا الليمفاوية في هذه الأنسجة ، على الرغم من الحد الأدنى من تلطيخ SARS-CoV-N (البيانات الموسعة الشكل 3g-j). 

لوحظ التهاب عضلة القلب اللمفاوي البؤري في حيوان واحد وتوافق مع وجود vRNA (البيانات الموسعة الشكل. 3k – l). 

تضمنت المواقع الأخرى للكشف عن الفيروس خلايا الدم وحيدة النواة في الدم المحيطي في الجلطة الرئوية (البيانات الموسعة الشكل 4 أ-ج) ونخاع عظم المحارة الأنفية (البيانات الموسعة الشكل 4 د-و).

أنتجنا ناقلات Ad26 المؤتلفة وغير المؤهلة للنسخ المتماثل 1) SARS-CoV-2 S مع حذف منطقة الغشاء والذيل السيتوبلازمي الذي يعكس المجال الخارجي القابل للذوبان مع مجال تقليم أضعاف (S.dTM.PP) أو 2) كامل الطول S (S.PP) ، مع طفرة في موقع انشقاق الفورين وطفرتين لتثبيت البرولين (الشكل 3 أ).

 لقد أبلغنا مؤخرًا عن الفعالية المناعية والوقائية لهذه اللقاحات ضد تحدي SARS-CoV-2 في قرود المكاك ريسوس.

 ، مناعة SARS-CoV-2 S مع 1) حذف منطقة الغشاء والذيل السيتوبلازمي الذي يعكس المجال الخارجي القابل للذوبان مع مجال تقليم أضعاف (S.dTM.PP) أو 2) كامل الطول S (S.PP) ، كلاهما مع طفرة في موقع انشقاق الفورين واثنين من طفرات استقرار البرولين. 

علامة X الحمراء تصور طفرة موقع انقسام الفوران ؛ خطوط عمودية حمراء تصور طفرات البرولين. 

ويصور المربع المفتوح مجال تقليم أضعاف. 

يمثل S1 و S2 المجال الأول والثاني لبروتين S ؛ TM يصور منطقة الغشاء. 

والتصوير المقطعي المحوسب يصور المجال السيتوبلازمي. 

تم تطعيم الهامستر بـ 1010 vp أو 109 vp من Ad26-S.dTM.PP أو Ad26-S.PP أو الضوابط الوهمية (ن = 10 لكل مجموعة). 

تم تقييم الاستجابات المناعية الخلطية في الأسابيع 0 و 2 و 4 ب) اختبارات تحييد الأجسام المضادة المرتبطة بـ RBD الخاصة بـ ELISA و c). 

تعكس الأشرطة الحمراء متوسط ​​الردود.

 تعكس الخطوط المنقطة حد الفحص للكميات. 

d و S- و RBD الخاصة بالفئة الفرعية IgG و FcγR و ADCD في الأسبوع 4 تظهر كمخططات رادار. يشير حجم وكثافة اللون للأوتاد إلى متوسط ​​السمة للمجموعة المقابلة (الفئة الفرعية للجسم المضاد ، أحمر ؛ ربط FcγR ، أزرق ؛ ADCD ، أخضر). ه ، مخطط PCA يظهر ملامح الجسم المضاد متعدد المتغيرات عبر مجموعات التطعيم. كل نقطة تمثل حيوان.

 لون النقطة يدل على المجموعة ؛ وتظهر الأشكال البيضاوية توزيع المجموعات على أنها 70٪ من مستويات الثقة بافتراض التوزيع الطبيعي متعدد المتغيرات.

 f ، تُظهر خريطة الحرارة الاختلافات في وسائل الميزات المسجلة z بين مجموعات اللقاح S.PP و S.dTM.PP. 

تمت مقارنة المجموعتين باختبارات مان ويتني على الوجهين ، وتشير النجوم إلى قيم q المصححة من Benjamini-Hochberg (* q <0.05 ، ** q <0.01 و *** q <0.001).

لقد قمنا بتحصين 50 هامسترًا ذهبيًا سوريًا بـ 1010 أو 109 جزيئات فيروسية (vp) من نواقل Ad26 التي ترميز S.dTM.PP أو S.PP (ن = 10 لكل مجموعة) أو عناصر تحكم زائفة (ن = 10). 

تلقت الحيوانات تطعيمًا واحدًا عن طريق الحقن العضلي في الأسبوع 0.

 لاحظنا وجود أجسام مضادة مرتبطة بمجال ارتباط المستقبلات (RBD) عن طريق مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) 1011 (الشكل 3 ب) والأجسام المضادة المعادلة (NAbs) بواسطة اختبار تحييد الفيروس الكاذب 10،11،21 (الشكل 3 ج) في جميع الحيوانات في الأسبوع 2 والأسبوع 4. 

في الأسبوع 4 ، أنتج Ad26-S.PP 4.0-4.7 ضعف متوسط ​​ELISA أعلى (4،470 ، 4،757) مقارنة بـ Ad26 -S.dTM.PP (1،014 ، 1،185) (الشكل 3 ب ؛ P <0.0001 ، اختبارات مان ويتني على الوجهين). 

وبالمثل ، استنتج Ad26-S.PP متوسط ​​1.8-2.6 ضعفًا متوسط ​​NAb IC50 أعلى (359 ، 375) مقارنة بـ Ad26-S.dTM.PP (139 ، 211) (P <0.05 ، اختبارات Mann-Whitney على الوجهين) .

 لكل ناقل ، بدت الجرعتان المختبرتان متشابهتين. تم ربط بيانات ELISA و NAb في كل من الأسبوع 2 والأسبوع 4 (R = 0.7074 ، P <0.0001 و R = 0.7849 ، P <0.0001 ، على التوالي ، اختبارات ارتباط رتبة سبيرمان على الوجهين ؛ البيانات الموسعة الشكل 5 أ).

قمنا أيضًا بتمييز استجابات الأجسام المضادة الخاصة بـ S والخاصة بـ RBD في الحيوانات المحصنة في الأسبوع 4 بواسطة مصل الأنظمة.

 تم تقييم IgG و IgG2a و IgG3 و IgM و Fc-receptors FcRγ2 و FcRγ3 و FcR and4 واستجابات ترسيب المكمل المعتمد على الجسم المضاد (ADCD) (الشكل ثلاثي الأبعاد - و). 

لوحظت استجابات أعلى وأكثر اتساقًا مع Ad26-S.PP مقارنة بـ Ad26.SdTM.PP (الشكل ثلاثي الأبعاد ، و) ، وأكد تحليل المكون الرئيسي (PCA) لميزات الجسم المضاد هذه أن هذين اللقاحين لهما ملامح مميزة (الشكل 3 هـ).

في الأسبوع 4 ، تم تحدي جميع الحيوانات بـ 5 × 105 TCID50 SARS-CoV-2 عن طريق الأنف.

 تم تشريح ثلاثة حيوانات في كل مجموعة في اليوم الرابع من الحمل الفيروسي للأنسجة والتشريح المرضي ، وتم متابعة الحيوانات السبعة المتبقية في كل مجموعة حتى اليوم الرابع عشر. 

في الضوابط الصورية ، فقد الهامستر متوسط ​​19.6٪ من وزن الجسم بحلول اليوم السابع ، و 43٪ (3/7) من الحيوانات التي تم اتباعها طوليًا استوفت معايير القتل الرحيم في الأيام 6-7 (الشكل 4 أ ، ب). 

فقدت الحيوانات الملقحة Ad26-S.dTM.PP متوسط ​​8.7٪ من وزن الجسم ، وفقدت الحيوانات الملقحة Ad26-S.PP متوسط ​​4.0٪ من وزن الجسم (الشكل 4 أ ، ب). 

كانت النسبة المئوية القصوى لفقدان الوزن أقل بشكل ملحوظ في كلتا المجموعتين المحصنتين مقارنةً بالضوابط الصورية (P <0.0001 ، اختبارات مان ويتني على الوجهين ؛ الشكل 4 ج) ، وأظهرت الحيوانات التي تلقت Ad26-S.PP فقدان وزن أقل من الحيوانات التي تلقت Ad26.S.dTM.PP (P <0.0001 ، اختبارات مان ويتني على الوجهين ؛ الشكل 4 ج). 

كلا اللقاحين محميان من الوفيات ، والتي تم تعريفها على أنها تلبي معايير القتل الرحيم الإنسانية ، مقارنةً بالضوابط الوهمية (P = 0.02 ، اختبارات فيشر الدقيقة على الوجهين ؛ البيانات الموسعة الشكل 5 ب). 

أكد تحليل مشترك لتجربتي الهامستر أن كلا اللقاحين يحميان بشكل فعال من الوفيات (P = 0.007 ، الاختبارات الدقيقة لفيشر على الوجهين ؛ البيانات الموسعة الشكل 5 ج). 

ترتبط استجابات ELISA في الأسبوع 2 (R = −0.8992 ، P <0.0001) والأسبوع 4 (R = −0.9344 ، P <0.0001) بشكل عكسي مع الحد الأقصى لفقدان الوزن بالنسبة المئوية (البيانات الموسعة الشكل 6 أ). 

استجابات NAb في الأسبوع 2 (R = −0.7380 ، P <0.0001) والأسبوع 4 (R = −0.8075 ، P <0.0001) مرتبطة أيضًا بشكل عكسي مع أقصى نسبة خسارة في الوزن (البيانات الموسعة الشكل 6 ب).

الشكل 4: المرض السريري في الهامستر بعد جرعة عالية من تحدي SARS-CoV-2.

 ، متوسط ​​الوزن بالنسبة المئوية للتغيير بعد التحدي.

 ب ، تغير الوزن بالنسبة المئوية بعد التحدي في الحيوانات الفردية. 

يتم تصوير متوسط ​​فقدان الوزن باللون الأحمر. 

تشير العلامات النجمية إلى معدل الوفيات. 

تشير الخطوط الرمادية إلى الحيوانات ذات التشريح المجدول في اليوم الرابع ج ، وفقدان الوزن الأقصى في Ad26-S.dTM.PP (العدد = 14) ، Ad26-S.PP (العدد = 14) والتحكم الوهمي (العدد = 7) المجموعات ، باستثناء الحيوانات التي تم تشريحها في اليوم الرابع ، تشير قيم P إلى اختبارات Mann-Whitney ثنائية الجانب.

 يعكس n جميع الحيوانات التي تم اتباعها لفقدان الوزن ولم يتم تشريحها في اليوم الرابع. 

d ، تحديد النسبة المئوية لمساحة الرئة الإيجابية لمضاد الحمض الريبي النووي الريبي (vRNA) في أقسام الأنسجة من الهامستر الملقح Ad26-S.dTM.PP و Ad26-S.PP بالمقارنة مع الهامستر المتحكم في اليوم الرابع بعد التحدي.

 تمثل قيم P اختبارات Mann – Whitney على الوجهين.

تم تقييم الأحمال الفيروسية للأنسجة في مجموعة فرعية من الحيوانات التي تم تشريحها في اليوم الرابع وفي بقية الحيوانات الباقية في اليوم الرابع عشر. 

في اليوم الرابع بعد جرعة عالية من اختبار SARS-CoV-2 ، تم اكتشاف الفيروس في الأنسجة في جميع الحيوانات عن طريق عكس الحمض النووي الريبي الجيني. النسخ - تفاعل البوليميراز المتسلسل (RT-PCR) ، والذي يُعتقد أنه يقيس تكرار الفيروس 10 ، 23 (البيانات الموسعة الشكل 7 أ). 

كان متوسط ​​الأحمال الفيروسية في أنسجة الرئة حوالي 1012 نسخة من الحمض النووي الريبي لكل جرام في الضوابط الوهمية مقارنة بـ 108 نسخة من الحمض النووي الريبي لكل جرام في الحيوانات المحصنة Ad26-S.dTM.PP و 106 نسخ من

 الحمض النووي الريبي لكل جرام في الحيوانات المحصنة Ad26-S.PP . لوحظ أيضًا انخفاض عيار الفيروسات المعدية TCID50 لكل جرام من أنسجة الرئة للحيوانات الملقحة Ad26-S.dTM.PP و Ad26.S.PP مقارنةً بالضوابط الوهمية (P = 0.02 و P = 0.01 ، على التوالي ، على الوجهين مان- اختبارات ويتني البيانات الموسعة الشكل 7 ب).

 بحلول اليوم 14 ، كان لا يزال يتم اكتشاف الفيروس في الرئة وأجزاء من الضوابط الوهمية الباقية ولكن لوحظ في أقلية فقط من الحيوانات المحصنة Ad26-S.dTM.PP وفي أي من الحيوانات المحصنة Ad26-S.PP (البيانات الموسعة الشكل . 7 ج).

استجابات ELISA في الأسبوع 2 (R = −0.8133 ، P = 0.0004) والأسبوع 4 (R = −0.9288 ، P <0.0001) مرتبطة عكسيًا مع الأحمال الفيروسية في الرئة في اليوم 4 (البيانات الموسعة الشكل 8 أ) ، واستجابات NAb في الأسبوع 2 (R = −0.7469 ،

 P = 0.0020) والأسبوع 4 (R = −0.6004 ، P = 0.0199) مرتبطان عكسيًا مع الأحمال الفيروسية الرئوية في اليوم 4 (البيانات الموسعة الشكل 8 ب). 

ترتبط استجابات ELISA و NAb أيضًا بشكل عكسي مع الأحمال الفيروسية في القرينات الأنفية (البيانات الموسعة الشكل 8 ج ، د).

 كشف تحليل أعمق للارتباطات المناعية أن خصائص الأجسام المضادة المتعددة ترتبط عكسياً بفقدان الوزن والأحمال الفيروسية للأنسجة (البيانات الموسعة الشكل 9 أ).

طورت عناصر التحكم الوهمية الباقية استجابات قوية للربط والمعادلة للأجسام المضادة بحلول اليوم 14 بعد التحدي (البيانات الموسعة الشكل 9 ب). 

أظهرت الحيوانات الملقحة أيضًا استجابات أعلى لـ ELISA و NAb بعد التحدي (البيانات الموسعة الشكل 9 ب) ، بما يتوافق مع الأحمال الفيروسية للأنسجة التي تظهر مستويات منخفضة وعابرة من تكاثر الفيروس في هذه الحيوانات بعد جرعة عالية من تحدي SARS-CoV-2.

أظهرت الحيوانات الملقحة أيضًا تناقصًا في علم الأمراض مقارنةً بالضوابط الوهمية في اليوم الرابع بعد التحدي (البيانات الموسعة الشكل 10). 

أظهرت الحيوانات المحصنة بـ Ad26-S.PP الحد الأدنى من عدم وجود دليل على وجود التهاب رئوي خلالي فيروسي ، أو اضطراب في الظهارة القصبية أو مجاميع محيطية من الخلايا الليمفاوية CD3 + T والضامة. 

تم تقليل التسربات الالتهابية المحببة للعدلات والمنسجة بشكل ملحوظ في جميع فصوص الرئة ، ولوحظ انخفاض كبير في SARS-CoV-2 vRNA في الهامستر المحصن Ad26-S.dTM.PP و Ad26-S.PP مقارنةً بالضوابط الزائفة (P = 0.004 و P = 0.004 ، على التوالي ، اختبارات مان ويتني على الوجهين ، الشكل 4 د).

في هذه الدراسة ، أظهرنا أن التحصين الفردي لناقل Ad26 الذي يشفر مقدمة كاملة الطول استقرت مناعة S (S.PP) المحمية ضد المرض السريري الحاد بعد جرعة عالية من تحدي SARS-CoV-2 في الهامستر. 

أظهرت الضوابط الشام فقدان الوزن بشكل ملحوظ ، والالتهاب الرئوي الحاد والوفيات الجزئية. 

في المقابل ، أظهرت الحيوانات التي تم تحصينها نقصًا بسيطًا في الوزن والالتهاب الرئوي وعدم وجود نفوق.

 يرتبط ارتباط وتحييد استجابات الأجسام المضادة الناتجة عن اللقاح بالحماية من المرض السريري وكذلك تقليل تكاثر الفيروس في الجهاز التنفسي العلوي والسفلي.

تتناقض شدة المرض السريري في هذا النموذج مع الدراسات السابقة التي تنطوي على عدوى SARS-CoV-2 في الهامستر 5،6،7 وأنواع أخرى 8،9،10،14،15،16،17،18.

 يعتبر الهامستر نموذجًا مسموحًا به لـ SARS-CoV-2 نتيجة لتماثلهم مع مستقبل ACE2 البشري ، وقد تم الإبلاغ عن انتقال العدوى بين الهامستر. أدت جرعة التحدي العالية إلى مرض إكلينيكي واسع النطاق في هذه الدراسة ، على الرغم من أن العوامل البيولوجية التي لا يزال يتعين تحديدها بالكامل قد تؤثر أيضًا على المرض السريري ، مثل عمر الحيوان والأصل الحيواني ومخزون التحدي الفيروسي.

أظهرت دراسات لقاح SARS-CoV-2 في الرئيسيات غير البشرية ، حتى الآن ، الحماية ضد العدوى أو الحد من تكاثر الفيروس في الجهاز التنفسي العلوي والسفلي.

 لقد أبلغنا أيضًا مؤخرًا أن التحصين الفردي لـ Ad26-S.PP وفر حماية كاملة أو شبه كاملة ضد تحدي SARS-CoV-2 في قرود المكاك. 

ومع ذلك ، فإن عدوى SARS-CoV-2 في الرئيسيات غير البشرية لا تؤدي إلى مرض إكلينيكي شديد أو وفيات.

 قد يكون نموذج المرض الشديد مفيدًا لاستكمال نماذج التحدي الحالية غير البشرية للرئيسيات ، لأن الحماية من تكاثر الفيروس لا تعني بالضرورة الحماية من المرض الشديد. في الواقع ، في التحليل التشريحي المرضي للهامستر في هذه الدراسة ، 

انخفضت الأحمال الفيروسية في الرئة من اليوم الثاني إلى اليوم السابع ، في حين استمرت علامات الالتهاب في التصاعد خلال هذه الفترة الزمنية وارتبطت بفقدان الوزن المستمر. 

تشير هذه البيانات إلى أن المرض السريري التدريجي في الهامستر هو في المقام الأول عملية التهابية ، والتي تسببها العدوى ولكنها استمرت في الزيادة حتى عندما انخفض تكاثر الفيروس.

نظرًا لأن COVID-19 في البشر يمكن أن يتطور إلى مرض سريري حاد ، فمن المهم اختبار لقاح SARS-CoV-2 في النماذج قبل السريرية التي تلخص المرض السريري الحاد ، بما في ذلك الالتهاب الرئوي الخاطف والوفيات. 

يحقق نموذج الهامستر عالي الجرعة الموصوف هنا العديد من هذه المعايير ، وبالتالي قد يكون مفيدًا لدراسة التسبب في المرض الشديد واختبار الإجراءات المضادة. 

كان المظهر الأساسي للمرض السريري في هذا النموذج هو الالتهاب الرئوي الحاد بدلاً من التهاب الدماغ الذي تم الإبلاغ عنه في بعض نماذج الفئران المعدلة وراثيًا hACE2. علاوة على ذلك ، ترتبط استجابات الأجسام المضادة الملزمة والمعادلة بالحماية.

باختصار ، تُظهر بياناتنا أن التحصين الفردي لـ Ad26-S.PP يوفر حماية قوية ضد الأمراض السريرية الشديدة بعد الإصابة بجرعة عالية من SARS-CoV-2 في الهامستر.

 على حد علمنا ، لم يتم الإبلاغ سابقًا عن حماية اللقاح ضد الالتهاب الرئوي الوخيم SARS-CoV-2 والوفيات. 

يتم حاليًا تقييم Ad26-S.PP ، والذي يُطلق عليه أيضًا Ad26.COV2.S ، في التجارب السريرية. يجب أن يكون نموذج مرض الهامستر الشديد هذا مفيدًا لاختبار لقاحات السارس-CoV-2 والعلاجات والإجراءات المضادة الأخرى.

طرق

الحيوانات وتصميم الدراسة

تم توزيع سبعين من الذكور والإناث من الهامستر الذهبي السوري (Envigo) الذين تتراوح أعمارهم بين 10-12 أسبوعًا بشكل عشوائي على المجموعات.

 تم إيواء جميع الحيوانات في Bioqual. 

تلقت الحيوانات نواقل Ad26 تعبر عن S.dTM.PP أو S.PP أو الضوابط الوهمية (ن = 10 لكل مجموعة).

 تلقت الحيوانات تحصينًا فرديًا قدره 1010 أو 109 vp Ad26 من خلال المسار العضلي بدون مواد مساعدة في الأسبوع 0. في الأسبوع 4 ، تم تحدي جميع الحيوانات بـ 5.0 × 105 TCID50 (6 × 108 vp ، 5.5 × 104 وحدات تشكيل البلاك (PFU ))

 أو 5.0 × 104 TCID50 (6 × 107 vp ، 5.5 × 103 PFU) SARS-CoV-2 ، والذي تم اشتقاقه بمقطع واحد من USA-WA1 / 2020 (NR-52281، BEI Resources) 10.

 تم إعطاء الفيروس بمقدار 100 ميكرولتر عن طريق الأنف (50 ميكرولتر في كل ناري). تم تقييم أوزان الجسم يوميا.

 تم إجراء جميع المقايسات المناعية والفيروسية 

 في اليوم الرابع ، تم التخلص من مجموعة فرعية من الحيوانات بسبب الأحمال الفيروسية في الأنسجة وعلم الأمراض. 

أجريت جميع الدراسات على الحيوانات وفقًا لجميع اللوائح المحلية والولائية والفيدرالية ذات الصلة وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية Bioqual.

Ad26 ناقلات

تم إنشاء متجهات Ad26 مع متغيرين من تسلسل بروتين SARS-CoV-2 S (ووهان / WIV04 / 2019 ؛ GenBank MN996528.1).

 تم تحسين وتوليف التسلسلات. 

تم إنتاج ناقلات Ad26 المحذوفة من E1 / E3 في PER.C6.TetR باستخدام بلازميد يحتوي على جينوم ناقل Ad26 الكامل وكاسيت التعبير الجيني.

 تضمنت ضوابط الشام ناقلات Ad26-Empty. تم ترتيب النواقل واختبارها للتعبير قبل الاستخدام.

علم التشريح المرضي و IHC

تم تثبيت الأنسجة في بارافورمالدهيد طازجًا بنسبة 4٪ لمدة 24 ساعة ، وتم نقلها إلى 70٪ إيثانول ، وبرافين مدمج في غضون 7-10 أيام وكتلة مقطوعة عند 5 ميكرومتر. 

تم تحميص الشرائح لمدة 30-60 دقيقة عند 65 درجة مئوية ثم إزالة الكافيين في الزيلين وترطيبها من خلال سلسلة من الإيثانول المتدرج إلى ماء مقطر. 

بالنسبة لـ SARS-CoV-N و Iba-1 و CD3 IHC ، تم إجراء استرجاع حلقية ناتجة عن الحرارة باستخدام قدر ضغط على إعداد البخار لمدة 25 دقيقة في محلول السترات (Thermo Fisher Scientific ، AP-9003-500) ، متبوعًا بالمعالجة 

باستخدام 3٪ بيروكسيد الهيدروجين. تم شطف الشرائح بعد ذلك في ماء مقطر وحظر البروتين (Biocare ، BE965H) لمدة 15 دقيقة متبوعًا بالشطف في 1 × PBS. 

جسم مضاد للبروتين النووي مضاد لـ SARS-CoV (Novus ، NB100-56576 ، في 1: 500 أو 1: 1000) ، جسم مضاد لـ Iba-1 للأرنب (Wako ، 019-19741 ، 

في 1: 500) أو مضاد للأرنب تم تطبيق CD3 (Dako ، A0452 ، عند 1: 300) لمدة 30 دقيقة ، يليه أرنب Mach-2 HRP-Polymer (Biocare ، RHRP520L) 

لمدة 30 دقيقة ثم تمت مواجهته باستخدام الهيماتوكسيلين متبوعًا بالتبييض باستخدام 0.25٪ من ماء الأمونيا. 

تم وضع الملصقات الخاصة بـ SARS-CoV-N و Iba-1 و CD3 على Biogenex i6000 Autostainer (الإصدار 3.02). 

في بعض الحالات ، تم إجراء تلطيخ CD3 و Iba-1 و ACE-2 باستخدام CD3 عند 1: 400 (Thermo Fisher Scientific ، cat. no. RM-9107-S ، clone SP7) ، Iba-1 at 1: 500 (Biocare ، القط ، رقم CP290A ، متعدد الأضلاع) أو

 ACE-2 (Abcam ، ab108252) ، وجميعها تم اكتشافها باستخدام Rabbit Polink-1 HRP (GBI Labs ، cat. no. D13–110). 

تم إجراء العدلة (MPO) واستجابة IFN من النوع 1 (Mx1) باستخدام MPO (داكو ، القط رقم A0398 ، متعدد الأضلاع) عند اكتشاف 1: 1000 باستخدام Rabbit Polink-1 HRP و Mx1 (EMD Millipore ، القط رقم MABF938 ،

 استنساخ M143 / CL143) عند اكتشاف 1: 1000 باستخدام Mouse Polink-2 HRP (مختبرات GBI ، القط رقم D37-110). 

تم إجراء تلطيخ لـ CD3 و Iba-1 و MPO و Mx1 IHC كما هو موصوف سابقًا باستخدام Biocare intelliPATH autostainer ، مع تحضين جميع الأجسام المضادة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

 تم تقييم أمراض الأنسجة بشكل مستقل من قبل اثنين من أخصائيي علم الأمراض البيطريين (AJM و CPM).

تهجين RNAscope في الموقع

تم إجراء تهجين RNAscope في الموقع كما هو موصوف سابقًا باستخدام مسبار خاص مضاد للحساسية SARS-CoV2 v-nCoV2019-S (ACD ، القط رقم 848561) يستهدف RNA الفيروسي الموجب المعنى ومسبار خاص بمعنى SARS-CoV2 v-nCoV2019- orf1ab-sense (ACD، cat. no. 859151) الذي يستهدف الجينوم vRNA ذي المعنى السلبي. 

باختصار ، بعد إزالة الكافيين من الشرائح في زيلين وترطيبها من خلال سلسلة من الإيثانول المتدرج إلى ماء مقطر ، تم إجراء الاسترجاع لمدة 30 دقيقة في محلول استرجاع ACD P2 (ACD ، القط رقم 322000) عند 95-98 درجة مئوية ، متبوعًا

 بذلك العلاج بالبروتياز III (ACD ، القط رقم 322337) المخفف بنسبة 1:10 في برنامج تلفزيوني لمدة 20 دقيقة عند 40 درجة مئوية. تم تحضين الشرائح بعد ذلك 

باستخدام 3٪ H2O2 في PBS لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة الغرفة. قبل التهجين ، تم طرد مخزون المسبار عند 13000 دورة في الدقيقة. باستخدام جهاز طرد مركزي دقيق لمدة 10 دقائق ثم تخفيفه 1: 2 في مادة مخففة مسبار (ACD ،

 القط رقم 300041) لتقليل تشوهات أنسجة تجميع المسبار.

تم تطوير الشرائح باستخدام RNAscope 2.5 HD Detection Reagents-RED (ACD ، القط رقم 322360).

التحليل الكمي للصورة

تم إجراء التحليل الكمي للصور باستخدام برنامج HALO (v2.3.2089.27 أو v3.0.311.405 ؛ Indica Labs) على مقطع عرضي واحد على الأقل من فص الرئة من كل حيوان. 

في الحالات التي يتوفر فيها أكثر من مقطع عرضي واحد ، تم تحديد كمية كل فص رئوي كنقطة بيانات فردية. 

بالنسبة لـ SARS-CoV-N ، تم استخدام خوارزمية Multiplex IHC v2.3.4 مع شاشة استبعاد للهيماتين الحمضي لتحديد النسبة المئوية للخلايا الإيجابية لبروتين SAR-N كنسبة من العدد الإجمالي للخلايا. 

بالنسبة لـ Iba-1 ، تم استخدام خوارزمية Multiplex IHC v2.3.4 للتقدير الكمي. 

بالنسبة لـ SARS-CoV-2 RNAscope ISH و Mx1 ، تم استخدام وحدة قياس المساحة v2.1.3 لتحديد النسبة المئوية لإجمالي مسبار SARS-CoV-2 المضاد للحس أو الإحساس أو بروتين Mx1 كنسبة من إجمالي مساحة الأنسجة. بالنسبة إلى 

MPO (العدلات) وتقدير الخلايا CD3 + ، تم شرح الشرائح لاستبعاد الأوعية الدموية (> 5 مم 2) والشعب الهوائية والقصيبات والغضاريف والنسيج الضام ؛ 

بعد ذلك ، تم استخدام الوحدة النمطية Cytonuclear v1.6 للكشف عن خلايا MPO + أو CD3 + وتم حساب التردد كنسبة من إجمالي الأنسجة السنخية (الكريات البيض متعددة الأشكال لكل مم 2) ،

 والتي تم تحديدها عن طريق تشغيل وحدة المساحة الكمية v2.1.3. في جميع الحالات ، تم إجراء فحص يدوي لجميع الصور على كل عينة للتأكد من دقة التعليقات التوضيحية.

مقايسة الرنا المرسال الجيني

تم تقييم مرنا تحت الجين الجيني SARS-CoV-2 E (sgmRNA) بواسطة RT-PCR باستخدام الاشعال والتحقيقات كما هو موضح سابقًا. 

باختصار ، تم استخراج الحمض النووي الريبي الكلي من متجانسات الأنسجة من عدة مواقع تشريحية باستخدام QIAcube HT (Qiagen) و RNeasy 96 QIAcube HT Kit (Qiagen).

 تم إنشاء منحنى قياسي باستخدام sgmRNA الجين SARS-CoV-2 E عن طريق الاستنساخ في بلازميد تعبير pcDNA3.1 ؛ تم نسخ هذا الإدخال باستخدام AmpliCap-Max T7 High Yield Message Maker Kit (Cellscript). 

قبل RT – PCR ، تم نسخ العينات التي تم جمعها من الحيوانات المعترض عليها أو المعايير باستخدام Superscript III VILO (Invitrogen) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. 

تم تصميم اختبار التعبير الجيني المخصص من Taqman (Thermo Fisher Scientific) باستخدام التسلسلات التي تستهدف الجين E sgmRNA. 

تم إجراء ردود الفعل على أنظمة QuantStudio 6 و 7 Flex Real-Time PCR (النظم البيولوجية التطبيقية) وفقًا لمواصفات الشركة المصنعة. 

تم استخدام المنحنيات القياسية لحساب نسخ sgmRNA لكل جرام نسيج. كانت حساسية الفحص الكمي 100 نسخة.

إليسا

تم تقييم الأجسام المضادة المرتبطة بـ RBD بواسطة ELISA بشكل أساسي كما هو موصوف. 

باختصار ، تم تغليف 96 طبقًا جيدًا بـ 1 ميكروغرام مل من بروتين SARS-CoV-2 RBD (آرون شميت ، اتحاد ماساتشوستس حول جاهزية مسببات الأمراض) أو 1 ميكروغرام مل من بروتين SARS-CoV-2 S (بيولوجي صيني) في 1 × محلول 

ملحي مخزّن بالفوسفات Dulbecco (DPBS) وحضنت عند 4 درجات مئوية طوال الليل. بعد الحضانة ، 

تم غسل الألواح مرة واحدة باستخدام محلول غسيل (0.05٪ توين -20 في 1 × DPBS) وتم منعها بـ 350 ميكرولتر من كتلة الكازين لكل بئر لمدة 2-3 ساعات عند درجة حرارة الغرفة. 

بعد الحضانة ، تم التخلص من محلول الكتلة وتم تجفيف الألواح. 

تمت إضافة تخفيفات متسلسلة بثلاثة أضعاف من المصل المعطل بالحرارة في كتلة الكازين إلى الآبار ، وتم تحضين الألواح لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة الغرفة. 

تم غسل الأطباق ثلاث مرات ثم حضنت لاحقًا لمدة ساعة واحدة باستخدام 0.1 ميكروغرام مل من مضاد الهامستر IgG HRP (SouthernBiotech) في كتلة الكازين عند درجة حرارة الغرفة في الظلام.

 تم غسل الأطباق ثلاث مرات ، ثم تمت إضافة 100 ميكرولتر من محلول SeraCare KPL TMB SureBlue Start لكل بئر ؛ توقف تطوير الألواح بإضافة 100 ميكرولتر من محلول SeraCare KPL TMB Stop لكل بئر.

 تم تسجيل الامتصاصية عند 450 نانومتر باستخدام قارئ الصفيحة الدقيقة VersaMax أو Omega. 

تم تعريف عدادات ELISA النهائية على أنها أعلى تخفيف مصل تبادلي أدى إلى امتصاص ضعفين فوق الخلفية.

مقايسة تحييد الفيروس الكاذب

تم إنشاء فيروسات SARS-CoV-2 الكاذبة التي تعبر عن جين مراسل لوسيفيراز في نهج مشابه لما هو موصوف سابقًا.

 باختصار ، تم نقل بناء العبوة psPAX2 (برنامج موارد وكاشف الإيدز) ، ومراسل luciferase plasmid pLenti-CMV Puro-Luc (Addgene) وبروتين S الذي يعبر عن pcDNA3.1-SARS CoV-2 SΔCT إلى خلايا HEK293T بواسطة lipofectamine 2000 ( ثيرمو فيشر العلمية).

 تم جمع المواد الطافية التي تحتوي على فيروسات النمط الكاذب بعد 48 ساعة من تعداء العدوى ؛ تمت تنقية فيروسات النمط الكاذب عن طريق الترشيح باستخدام مرشح 0.45 ميكرومتر.

 لتحديد نشاط تحييد المضاد من الحيوانات المحصنة ، تم زرع خلايا HEK293T-hACE2 في 96 طبقًا لزراعة الأنسجة بكثافة 1.75 × 104 خلية لكل ليلة كاملة. 

تم تحضير تخفيفات متسلسلة ثلاث مرات لعينات المصل المعطل بالحرارة وخلطها مع 50 ميكرولتر من الفيروس الكاذب. 

تم تحضين الخليط عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة قبل إضافته إلى خلايا HEK293T-hACE2.

 بعد ثمانية وأربعين ساعة من الإصابة ، تم إفساد الخلايا في Steady-Glo Luciferase Assay (Promega) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. 

تم تعريف عيار تحييد SARS-CoV-2 على أنه تمييع العينة حيث لوحظ انخفاض بنسبة 50٪ في وحدات الإضاءة النسبية بالنسبة إلى متوسط ​​آبار التحكم في الفيروسات

لومينيكس

للكشف عن الكمية النسبية من عيار الأجسام المضادة الخاصة بالمستضد ، تم إجراء اختبار Luminex المخصص كما هو موضح سابقًا. 

بموجب هذا ، تم ربط الكرات المجهرية المسمى الفلورسنت (Luminex) بمستضدات SARS-CoV-2 بما في ذلك بروتين S (إريك فيشر ، معهد دانا فاربر للسرطان) ، S1 و S2 (سينو بيولوجي) ، وكذلك RBD (آرون شميدت ، معهد راجون) عبر روابط 

تساهمية N-hydroxysuccinimide (NHS) –ester عبر EDC (Thermo Fisher Scientific) و Sulfo-NHS (Thermo Fisher Scientific). 

بعد ذلك ، تمت إضافة 1.2 × 103 حبة لكل منطقة ومستضد إلى لوحة 384 بئر (Greiner) واحتضانها بمصل مخفف (1:90 لـ IgG2a و IgG3 و IgM ؛ 1: 500 لإجمالي فحوصات ربط مستقبلات IgG و Fc) لمدة 16 ساعة اهتزاز عند 900 دورة في الدقيقة عند 4 درجات مئوية.

 بعد تكوين المجمعات المناعية ، تم غسل الكرات المجهرية ثلاث مرات في 0.1٪ ألبومين مصل بقري و 0.05٪ توين -20 (محلول اختبار Luminex) باستخدام غسالة لوحية آلية (Tecan). 

تم تخفيف الأجسام المضادة للكشف عن الأجسام المضادة IgG و IgG2a و IgG3 و IgM (SouthernBiotech) المسمى بـ PE في محلول اختبار Luminex إلى 0.65 ميكروغرام مل واحتضانها بالخرز لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة بينما تهتز عند 900 دورة في الدقيقة. 

وبالمثل ، بالنسبة لملفات ارتباط مستقبلات Fc ، تم ربط الفأر المؤتلف FcγR2 و FcγR3 و FcγR4 (مرفق إنتاج بروتين Duke) بيوتينيل (Thermo Fisher Scientific) وتم ربطه بـ Streptavidin-PE لمدة 10 دقائق قبل إضافة العينات (SouthernBiotech).

 هذه الأجسام المضادة والبروتينات في الفئران تتفاعل مع الهامستر. 

تم بعد ذلك غسل الخرزات المطلية وقراءتها على مقياس التدفق الخلوي ، iQue (IntelliCyt) ، مع ربط ذراع روبوت (PAA). 

تم إغلاق الأحداث في كل منطقة حبة ؛ تم الإبلاغ عن مضان متوسط ​​لـ PE للأحداث الإيجابية للخرز. 

تم تشغيل العينات في نسختين لكل عامل اكتشاف ثانوي.

ADCD

تم إجراء فحوصات ADCD كما هو موضح سابقًا.

 باختصار ، تم عزل سارس- CoV-2 S و RBD بيوتينيل (Thermo Fisher Scientific) واقترن بحبات نيوترافيدين نيوترافيدين حمراء 1 ميكرومتر (Thermo Fisher Scientific) لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية ،

 وتم غسل المستضد الزائد بعيدًا بعد ذلك. 

لتشكيل المجمعات المناعية ، تمت إضافة 1.82 × 108 حبات مغلفة بالمستضد إلى كل بئر من صفيحة سفلية مستديرة 96 بئر وحضنت مع 1:10 عينات مخففة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين. 

تمت إعادة تكوين مكمل خنزير غينيا المجفف بالتجميد وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة (سيدارلين) بالماء ، وتمت إضافة 4 ميكرولتر لكل بئر في المخزن المؤقت الجيلاتيني الذي يحتوي على Mg2 + و Ca2 + (GVB ++ ، Boston BioProducts) إلى المجمعات المناعية لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية. 

تم غسل المجمعات المناعية بـ 15 ملي إيثيلين ديامينيتراسيتيك حمض في PBS ، وأضيف جزء IgG من الماعز المترافق بالفلورسين إلى مكمل C3 لخنزير غينيا (MP Biomedicals).

 بعد التلوين ، تم إصلاح العينات بنسبة 4 ٪ لامتصاص العرق ، وتم إجراء الحصول على العينة عبر قياس التدفق الخلوي (IntelliCyt ، iQue Screener Plus) باستخدام ذراع روبوت (PAA). 

تم تحديد جميع الأحداث على خلايا مفردة وأحداث إيجابية للخرز ؛ تم الإبلاغ عن متوسط ​​الأحداث الإيجابية لـ C3. 

تم تشغيل جميع العينات في نسختين في أيام منفصلة.

تحليل احصائي

تم إجراء تحليل للبيانات المناعية والفيروسية ووزن الجسم باستخدام GraphPad Prism 8.4.2 (برنامج GraphPad).

 تم إجراء مقارنة البيانات بين المجموعات باستخدام اختبارات مان ويتني على الوجهين.

 تم تقييم الوفيات من خلال الاختبارات الدقيقة التي أجراها فيشر على الوجهين. 

تم تقييم الارتباطات عن طريق اختبارات ارتباط رتبة سبيرمان على الوجهين.

 اعتبرت قيم P أقل من 0.05 كبيرة.

 تم تحويل جميع بيانات الأمصال للأنظمة log10. 

بالنسبة إلى مخططات الرادار ، تمت تسوية كل ميزة من سمات الجسم المضاد بحيث تكون قيمتها الدنيا 0 والقيمة القصوى هي 1 عبر المجموعات قبل استخدام الوسيط داخل المجموعة. 

تم إنشاء PCA باستخدام حزمة R الإصدار 3.6.1 "ropls" لمقارنة ملفات التعريف متعددة المتغيرات. 

من أجل التصور في خريطة الحرارة ، تم عرض الاختلافات في وسائل مجموعات S.dTM.PP و S.PP لميزات z-scored. للإشارة إلى الدلالات في الخرائط الحرارية ، تم استخدام تصحيح بنجاميني-هوشبيرج لتصحيح مقارنات متعددة داخل صف واحد.

References

1.

Li, Q. et al. Early transmission dynamics in Wuhan, China, of novel coronavirus-infected pneumonia. N. Engl. J. Med. 382, 1199–1207 (2020).

2.

Zhu, N. et al. A novel coronavirus from patients with pneumonia in China, 2019. N. Engl. J. Med. 382, 727–733 (2020).

3.

Chen, N. et al. Epidemiological and clinical characteristics of 99 cases of 2019 novel coronavirus pneumonia in Wuhan, China: a descriptive study. Lancet 395, 507–513 (2020).

4.

Huang, C. et al. Clinical features of patients infected with 2019 novel coronavirus in Wuhan, China. Lancet 395, 497–506 (2020).