" Follow //zikroarg.com/4/4486087 //soaheeme.net/4/4486081 ". https://fjorden-faster-camera-controls.kckb.st/abeerabdalla " //oackoubs.com/4/4196661 //soaheeme.net/4/4196659 " " //soaheeme.net/4/4150620 //couptoug.net/4/4150608 https://propellerads.com/publishers/?ref_id=emae " //azoaltou.com/afu.php?zoneid=3654888 بديل بكتيري للكلى name="propeller""".
U3F1ZWV6ZTQ1NTI2MjU1ODUwODg2X0ZyZWUyODcyMTg5ODg4NTM0Nw==

لتعرف على كل جديد

تميز بلا حدود

بديل بكتيري للكلى

بديل بكتيري للكلى



 بديل بكتيري للكلى

كوكتيل ميكروبي يتم توصيله عن طريق الفم لإزالة النفايات الأيضية النيتروجينية في النماذج الحيوانية للفشل الكلوي

يحتاج مرضى الفشل الكلوي عادةً إلى غسيل الكلى لإزالة النفايات النيتروجينية ولتقليل العبء على الكلى. 

هنا ، نوضح أن كوكتيلًا بكتيريًا يتم تناوله عن طريق الفم في الحيوانات المصابة بإصابة في الكلى يمكن أن يستقلب نفايات الدم النيتروجينية قبل أن تنتشر عبر حاجز الغشاء المخاطي المعوي. 

يتكون الكوكتيل الميكروبي من ثلاث سلالات من البكتيريا المعزولة من الجراثيم البرازية التي تستقلب اليوريا والكرياتينين إلى أحماض أمينية ، ويتم تغليفها في كريات مجهرية من ألجينات الكالسيوم مغلفة بطبقة بوليدوبامين قابلة للنفاذ انتقائيًا للنفايات النيتروجينية ذات الجزيئات الصغيرة. 

في نماذج الفئران لإصابات الكلى الحادة والفشل الكلوي المزمن ، وفي نماذج الفشل الكلوي الخنازير ، قلل الكوكتيل الميكروبي المغلف بشكل كبير من تركيز اليوريا والكرياتينين في الدم ، ولم يؤد إلى أي آثار سلبية.

كمرض مميت يصيب 500 مليون مريض في جميع أنحاء العالم ، يصاحب الفشل الكلوي تراكم النفايات السامة ، بما في ذلك اليوريا والكرياتينين وكبريتات بي كريسول وإندوكسيل سلفيت ومشتقات إندول وأكسيد ثلاثي ميثيل أمين. 

هذا التراكم هو أيضًا سبب لتطور تلف الكلى.

 على الرغم من الكفاءة العالية لغسيل الكلى الغازي في إزالة المحاليل اليوريمية غير المرتبطة بالبروتين ، إلا أن العلاج المتكرر لا يزال يؤثر بشكل خطير على نوعية حياة المرضى ويصاحب ذلك آثار ضائرة مميتة.

 في السابق ، تم تصميم المواد القابلة للحقن مثل DNA Origami و nano-liposomes لتقليل وتيرة غسيل الكلى في مرضى الفشل الكلوي 5،6،7،8. ومع ذلك ، لا تزال هناك حاجة للعمليات الغازية لهذه الأساليب. يمكن أن يؤدي تطوير علاج غير جراحي إلى تقليل عبء المرضى.


الغشاء المخاطي المعوي هو أكبر بنية شبه منفذة في جسم الإنسان ويسمح بتبادل المستقلب بين الدم والقناة المعوية 9. 

بالإضافة إلى ذلك ، فإن القناة المعوية تتصل مباشرة بالبيئة الخارجية. 

يمكن تنظيم البيئة الداخلية من الأمعاء بطريقة غير جراحية من خلال الإعطاء الفموي 10. 

أكثر من 100 مليار بكتيريا تستعمر الأمعاء البشرية ، وتشارك في العديد من الوظائف الفسيولوجية للمضيفين 11 ، 12. 

في الآونة الأخيرة ، أصبح الارتباط بين ميكروبيوتا الأمعاء وتطور الأمراض المرتبطة بالتمثيل الغذائي أكثر وضوحًا. 

على سبيل المثال ، تم العثور على Klebsiella terrigena لتحويل الميلامين مباشرة إلى حمض السيانوريك ويسبب تسمم الميلامين. لقد ثبت أن Bifidobacterium pseudocatenulatum تخفف من مرض السكري من النوع 2 عن طريق توليد الأحماض الدهنية قصيرة السلسلة.

 يوفر تنظيم الجراثيم الأمل في العلاج غير الجراحي للأمراض.

حتى الآن ، اعتمد تنظيم البكتيريا العلاجية في الغالب على استراتيجيات البيولوجيا التركيبية.

 تمت دراسة الإمكانات العلاجية للبكتيريا المهندسة بدوائر استشعار النصاب بشكل جيد في الفئران الحاملة للورم. 

قام العمل الرائد بهندسة Escherichia coli للتعبير عن L-amino acid deaminase و phenylalanine amonia lyase تحت ضوابط نسخ مختلفة.

تعمل هذه الاستراتيجية على تحطيم الفينيل ألانين بنجاح في كل من المناطق الهوائية ونقص الأكسجة في الجهاز الهضمي. 

على الرغم من هذه الإنجازات ، فإن الأنواع المحدودة من السلالات التي يمكن تعديلها وراثيًا ، جنبًا إلى جنب مع سلامة البكتيريا المعدلة وراثيًا للعلاج البشري ، تحد بشكل كبير من تطوير علاجات الجراثيم. 

في السابق ، من خلال استخدام وظائف متعددة الاستخدامات والتعديلات السهلة للمواد الاصطناعية ، تم إعداد سلسلة من الكائنات التي تدعم المواد ، بما في ذلك الضامة المغناطيسية ، والبكتيريا التي يتم التحكم فيها ضوئيًا والفيروسات المحملة بالجسيمات النانوية 20 للأغراض الطبية الحيوية. 

بتشجيع من هذه النتائج ، افترضنا أن مثل هذه التعديلات غير الجينية القائمة على علم المواد قد توفر استراتيجية لتنظيم الجراثيم وتخفيف الفشل الكلوي.


هنا ، نُبلغ عن تصميم نظام بيئي ميكروبيوم فموي صغير يعمل على تحطيم النفايات النيتروجينية المعوية. 

أولاً ، تم بناء مجتمع ميكروبي صناعي يحول النفايات الأيضية إلى مغذيات. 

تمتلك الميكروبات القدرة الكاملة على استقلاب أنواع مختلفة من النفايات النيتروجينية. 

للتحقق من فكرة إزالة المخلفات النيتروجينية في الدم من الأمعاء ، اخترنا البكتيريا التي يمكنها استقلاب اليوريا أو الكرياتينين لهذا البحث. 

تم عزل سلالتين من البكتيريا التي يمكن أن تحول اليوريا بكفاءة (سلالة 1 ، تنتمي إلى جنس Escherichia) أو الكرياتينين (سلالة 2 ، تنتمي إلى جنس Bacillus) إلى الأمونيا من الميكروبات البرازية للفئران. 

بالنظر إلى السمية العالية للأمونيا ، تم أيضًا عزل سلالة من البكتيريا المعوية (السلالة 3) قادرة على تحويل الأمونيا إلى أحماض أمينية ودمجها مع السلالة 1 والسلالة 2. 

من خلال تقنية الموائع الدقيقة ، تم تغليف البكتيريا في كريات ألجينات الكالسيوم لتحقيقها التوطين المكاني المشترك . 

وهكذا ، أنشأنا نظامًا بيئيًا صناعيًا يعتمد على ثلاثة أجناس بكتيرية مختلفة لتسهيل عملية التمثيل الغذائي بين السلالات المختلفة.

 تمت بلمرة طبقة من بوليدوبامين (PDA) نانوفيلم على سطح الكرات الدقيقة في الموقع ، مما سمح بشكل انتقائي لمصدر النيتروجين الجزيئي الصغير بدخول النظام البيئي الدقيق البكتيري (BME) ، لمنع الاستهلاك الزائد للجزيئات النيتروجينية الكبيرة. 

أتاح هذا الطلاء أيضًا زيادة معدل تحلل النفايات النيتروجينية في البيئات المعقدة. افترضنا أن تناول BME عن طريق الفم يمكن أن يزيل النفايات الأيضية بكفاءة دون إحداث آثار ضارة واضحة

 

بديل بكتيري للكلى



، تخطيطي لتحضير BME لإزالة النفايات الأيضية وتخفيف الفشل الكلوي. 

يتم عزل ثلاث سلالات من البكتيريا التي يمكنها استقلاب اليوريا والكرياتينين إلى أحماض أمينية من الكائنات الحية الدقيقة البرازية لتحليل النفايات النيتروجينية. 

من خلال تقنية ميكروفلويديك والبلمرة في الموقع ، يتم تغليف هذه البكتيريا في بيئة مكروية اصطناعية ، والتي تتحكم في التوزيع المكاني للبكتيريا وتنظم بشكل انتقائي تبادل المواد. 

يتم فصل البكتيريا والبروتينات الأخرى التي قد تؤثر على فعالية الميكروبات الاصطناعية. 

 ، مقارنة البكتيريا المختارة والبكتيريا البرازية الكلية في تحلل اليوريا والكرياتينين.

تمت إضافة البكتيريا التي لها نفس التركيز إلى وسط استزراع M9 المحتوي على اليوريا أو الكرياتينين. 

يتم عرض خمس مكررات بيولوجية. 

 ، كفاءة السلالات البكتيرية 1 و 2 و 3 في تحلل اليوريا (ج) و NH3 (د) والكرياتينين (هـ) وتوليد الأحماض الأمينية (و). 

في 24 ساعة ، تم جمع وسط الثقافة لقياس محتويات الأحماض الأمينية. 

يتم عرض ثلاث مكررات بيولوجية. 

g ، قطع سطحية ثلاثية الأبعاد لليوريا 

 وتدهور الكرياتينين  بمزيج من ثلاث سلالات من البكتيريا بنسب مختلفة. 

تُظهر نسبة السلالة 1: السلالة 2: نسبة السلالة 3 بنسبة 3: 3: 4 أعلى فعالية. تم تقييم عدد كل سلالة من البكتيريا بواسطة cf.u. تصفيح. 

يتم عرض القيم المتوسطة لثلاث مكررات بيولوجية.

 تم حساب الأهمية بين كل مجموعتين باستخدام اختبار الطالب ثنائي الذيل (ب) أو تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) مع اختبار Tukey اللاحق (c-f). يعني القيم ± sd. يتم تقديمها.


نتائج ومناقشة

الفحص البكتيري

تم جمع عينات براز من أربعة أنواع مختلفة من الفئران (BALB / c و ICR و C57BL / 6J و C3H). 

أولاً ، حاولنا عزل البكتيريا القادرة على استقلاب النفايات النيتروجينية في ظل ظروف لاهوائية.

 ومع ذلك ، في ظل الظروف المستخدمة (الطرق التكميلية) ، لم نتمكن من عزل البكتيريا اللاهوائية على وسائطنا الانتقائية.

 قد يكون هذا بسبب ظروف الاستزراع غير المناسبة ونقص العناصر الغذائية في الوسط. 

قمنا أيضًا بعزل البكتيريا اللاهوائية الاختيارية من عينات البراز. 

تم استخدام الوسائط الانتقائية التي تحتوي على الجلوكوز كمصدر للكربون واليوريا أو الكرياتينين كمصادر للنيتروجين لعزل السلالات البكتيرية المهينة للنفايات بطريقة هوائية. 

تم عزل سلالتين من البكتيريا التي يمكن أن تستخدم اليوريا (السلالة 1) أو الكرياتينين (السلالة 2) كمصدر رئيسي للنيتروجين من الفئران BALB / c. بالمقارنة مع الميكروبات المختلطة من البراز ، يمكن للبكتيريا المعزولة أن تتحلل بسرعة من النفايات النيتروجينية في وسط M9 المضاف إليه اليوريا أو الكرياتينين . 

بشكل عام ، تكون البكتيريا قادرة على تحويل مصادر النيتروجين العضوي إلى أمونيا (NH3) 23.

 قد تزيد الجرعة العالية من امتصاص الأمونيا من خطر فرط أمونيا الدم. وهكذا ، قمنا أيضًا بعزل سلالة من البكتيريا (السلالة 3) من الفئران C57BL / 6J.

 في الوسط مع الأمونيا كمصدر للنيتروجين ، تم العثور على السلالة 3 لتحويل الأمونيا بكفاءة إلى أحماض أمينية ، والتي يمكن امتصاصها واستخدامها من قبل المضيفين . 

بعد ذلك ، تم استخدام محلل الأحماض الأمينية لتقدير توليد الأحماض الأمينية. 

الأحماض الأمينية التي تنتجها السلالة 3 كانت بشكل رئيسي ألانين ، ليسين وتيروزين. 

تم إجراء التحديد البكتيري عن طريق التضخيم النوعي للحمض النووي الريبوزومي 16S.

 تم تحديد السلالات البكتيرية 1 و 2 على أنها تنتمي إلى جنس Escherichia و Bacillus ، على التوالي. 

وفي الوقت نفسه ، تم العثور على السلالة 3 لتكون عضوا في جنس Enterobacter . 

هنا ، اخترنا اليوريا والكرياتينين كنموذج جزيئات للدراسة. 

على الرغم من الإشارة إلى سمية اليوريا 26،27،28،29،30،31 ، لا تزال سمية الكرياتينين غير واضحة. 

لا تشمل النفايات النيتروجينية المتولدة أثناء الفشل الكلوي اليوريا والكرياتينين فحسب ، بل تشمل أيضًا جزيئات مثل أكسيد ثلاثي ميثيل أمين ومشتقات الإندول.

 بالنظر إلى القدرة الاستقلابية القوية للبكتيريا ، يمكن توسيع وظيفة الجراثيم الاصطناعية.

 بالإضافة إلى ذلك ، فإن معظم الجهاز الهضمي يعاني من نقص الأكسجين.

 في الدراسات المستقبلية ، سيكون من الصعب تطوير علاج فعال في كل من البيئات الهوائية واللاهوائية

بعد الانتهاء من الفحص البكتيري ، قمنا بالتحقيق فيما إذا كان مزيج هذه البكتيريا يمكن أن يحقق سلسلة التمثيل الغذائي كما هو متوقع. 

أولاً ، قمنا بمقارنة كفاءة السلالة 1 أو السلالة 3 أو الخليط (السلالة 1 والسلالة 3) لتحلل اليوريا. 

السلالة 3 وحدها كان لها تأثير ضئيل على تحلل اليوريا. 

في غضون 24 ساعة ، خفضت السلالة 1 تركيز اليوريا من 20.4 إلى 3.7 ملي مولار. 

بالنسبة للخليط (السلالة 1: السلالة 3 = 1: 1) ، لا يزال تركيز اليوريا ينخفض ​​إلى 7.0 ملي مولار خلال نفس الفترة .

 سريريًا ، تعتبر قيمة نيتروجين اليوريا في الدم التي تتجاوز 8.21 ملي مولار مؤشرًا على الفشل الكلوي.

 في تجربة المحاكاة في المختبر ، يمكن لكل من السلالة 1 والمزيج خفض مستوى اليوريا إلى المعدل الطبيعي. 

أثناء تناول اليوريا ، أنتجت السلالة 1 باستمرار NH3 السام للخلايا. 

ومع ذلك ، أدى الاستخدام المشترك للسلالة 1 والسلالة 3 إلى تقليل إنتاج NH3 بنسبة 45٪ دون التأثير بشكل كبير على معدل تحلل اليوريا . 

وفي الوقت نفسه ، أدى الجمع بين ثلاث سلالات إلى إنتاج المزيد من الأحماض الأمينية . 

بالإضافة إلى ذلك ، انخفض تركيز الكرياتينين من 8.5 ~ إلى 4 ملي مولار خلال 12 ساعة ، إما في السلالة 2 أو عن طريق تآزر السلالة 2 والسلالة 3 المعالجة . 

تم اختبار مخاليط السلالات الثلاث بنسب خلط مختلفة (36 نسبة). 

استخدمنا الخليط البكتيري (السلالة 1: السلالة 2: السلالة 3 = 3: 3: 4) بأعلى فعالية لمزيد من الدراسات


بناء BME

بعد ذلك ، اكتشفنا ما إذا كانت هذه البكتيريا يمكنها إزالة النفايات النيتروجينية في الجسم الحي. 

في تجاربنا الأولية ، لوحظت مشكلتان خطيرتان حالتا دون مزيد من التطبيقات لهذا العلاج في الجسم الحي. 

وفقًا للأدبيات ، تميل البكتيريا المختلفة إلى استعمار مواقع مختلفة من الأمعاء ، وقد تؤدي العزلة المكانية إلى قطع تبادل المواد بين ثلاث سلالات بكتيرية.

 هنا ، تم تصنيف السلالة 1 ، السلالة 2 والسلالة 3 بالفلورسين ، رودامين ب أيزوثيوسيانات (RhB) وسيانين 5 (Cy5) ، على التوالي. 

تم إجراء التصوير الفلوري خارج الجسم الحي لتصور التوزيعات البكتيرية في الأمعاء. 

بعد إعطاء السلالات البكتيرية الثلاث ، تميل السلالة 2 إلى الإثراء في الجزء الأمامي من الأمعاء الدقيقة.

 ومع ذلك ، فإن السلالة 3 لا تظهر فقط في الأمعاء الدقيقة ولكنها أيضًا مخصبة بشكل كبير في القولون والأور. 

لذلك ، حاولنا إيجاد استراتيجية لإبقاء البكتيريا الثلاثة في نفس الوضع بعد دخولها في الجهاز الهضمي. 

هنا ، تم إجراء تغليف قائم على تكنولوجيا الموائع الدقيقة . 

باستخدام مولد قطيرات ميكروفلويديك من النوع T لخلط ألجينات الصوديوم وكلوريد الكالسيوم والبكتيريا ، تمكنا من تصنيع البكتيريا المغلفة بواسطة كريات ألجينات الكالسيوم المجهرية (Bacteria @ MSs). 

قدم الفحص المجهري الإلكتروني (SEM) نظرة ثاقبة على مورفولوجيا Bacteria @ MSs ، ولوحظت المجالات الخشنة بأقطار تقارب 90 ميكرون. سمحت استراتيجية التعبئة والتغليف بالتوطين المشترك الخاص للسلالات البكتيرية الثلاثة في الجهاز الهضمي

في البيئة المعقدة للجهاز الهضمي ، حيث توجد البروتينات والمركبات الأخرى ، يصعب على البكتيريا الاستفادة من مصادر النيتروجين مثل اليوريا والكرياتينين. 

 ، أدى وجود البروتينات إلى الحد بشكل كبير من قدرة خليط البكتيريا على الاستفادة من النفايات النيتروجينية. 

لذلك ، كانت هناك حاجة ماسة إلى طبقة من الغشاء الانتقائي الذي يمكن أن يتحكم في دخول مصادر النيتروجين مع منع انتشار المركبات الأخرى لطلاء الكرات المجهرية. 

هنا ، قمنا بفحص المواد المرشحة التي كانت منتجات معتمدة من إدارة الغذاء والدواء الأمريكية أو في قائمة "المعترف بها عمومًا على أنها آمنة". 

تم طلاء هذه المركبات على غشاء مرشح متعدد رباعي فلورو إيثيلين (PTFE) ، متبوعًا باختبارات نفاذية اليوريا وألبومين مصل الأبقار (BSA)

. PDA عبارة عن فئة من البوليمرات الشبيهة بالميلانين والتي يتم بلمرةها من الدوبامين وتتمتع بسلامة حيوية عالية. 

بالمقارنة مع المواد الأخرى المرشحة ، أظهر غشاء المساعد الرقمي الشخصي أعلى نفاذية لمصادر النيتروجين ذات الجزيئات الصغيرة وأقوى تأثير حاجز نحو انتشار البروتينات الجزيئية . 

وفقًا للتجارب المذكورة أعلاه ، قمنا ببلمرة PDA على سطح Bacteria @ MSs لبناء BME. 

بالإضافة إلى ذلك ، نجح التغليف في زيادة معدل البكتيريا في تدهور النفايات النيتروجينية في الوسط المحتوي على البروتين . 

بعد تغليف BME ، نمت مجموعات السلالات البكتيرية الثلاثة معًا وأظهرت نمط نمو مشابهًا لذلك في التعايش.

 في المقابل ، عندما تمت إضافة ثلاث سلالات مباشرة إلى وسط الاستزراع ، أظهرت المجموعات السكانية المختلفة علاقة تنافسية ، حيث تم القضاء على السلالات البكتيرية 1 و 2 ، واستمرت السلالة 3 في التكاثر.


بعد ذلك ، قمنا بالتحقق مما إذا كانت البكتيريا غير المغلفة الموجودة أثناء بناء BME يمكن أن تسهم في التمثيل الغذائي في المختبر. 

أولاً ، اكتشفنا المحتوى البكتيري في المادة الطافية بعد الطرد المركزي للحصول على BME. 

وجد أن عددًا قليلاً جدًا من البكتيريا (1.7٪) لم يتم تغليفها في BME . 

في ظل نفس الظروف ، تم تحلل حجم صغير فقط من النفايات النيتروجينية (اليوريا) بواسطة بكتيريا غير مغلفة . 

أثناء تحضير BME ، تم إجراء العديد من أجهزة الطرد المركزي منخفضة السرعة (954 جم) لإثراء BME وإزالة البكتيريا غير المغلفة . 

نتيجة لذلك ، بقيت القليل من البكتيريا غير المغلفة في BME المحضر.

نؤكد كذلك قدرة BME على تنظيم انتشار المواد المختلفة. 

 بالنسبة للجزيئات الصغيرة مثل RhB والبولي إيثيلين جلايكول (PEG) 600-RhB ، فإن BME بالكاد يمكن أن يؤثر على انتشارها. 

كلما زاد الوزن الجزيئي ، زادت أهمية تأثير BME في منع الانتشار الجزيئي. 

قلل طلاء PDA من تغلغل BSA (بروتين 66.4 كيلو دالتون) بنسبة 82.9٪. كان من الصعب على الجزيئات الكبيرة - سواء كانت موجبة الشحنة (بولي إيثيلين إيمين (PEI)) أو سالبة الشحنة (حمض بولي أكريليك) - أن تنتشر في BME.


تمت دراسة تأثير BME على انتشار الجزيئات الصغيرة. 

تم جمع السائل المعوي لفئران BALB / c ، متبوعًا بالخلط مع Bacteria @ MSs أو BME.

 بعد الزراعة المشتركة ، تم غسل وتجانس Bacteria @ MSs أو BME.

 تم تحليل أنواع ومحتويات المركبات في السائل المعوي والمتجانسة باستخدام كروماتوغرافيا الغاز - مطياف الكتلة (GC / MS). 

أثر طلاء PDA أيضًا بشكل كبير على تغلغل الجزيئات الصغيرة. 

كانت المركبات المحتوية على النيتروجين ، مثل الكرياتينين واليوراسيل ، أكثر احتمالا لدخول BME.

 بعد ذلك ، حصلنا على الخصائص الجزيئية النظرية ، بما في ذلك الوزن الجزيئي ، ومستقبلات الهيدروجين ، والمتبرعين بالهيدروجين ، ومساحة السطح القطبية و pKa لهذه المستقلبات من قاعدة بيانات SciFinder. 

تم إجراء تحليل الانحدار الخطي لهذه الخصائص الجزيئية مع كفاءات الانتشار الخاصة بها ، واستخدم مخطط الرادار لعرض نتائج الانحدار الخطي.

من المرجح أن تنتشر الجزيئات ذات pKa الأعلى ومستقبلات رابطة الهيدروجين أكثر في BME. 

من قبيل الصدفة ، يمكن لكتلة من النفايات النيتروجينية أن تفي بهذين الشرطين من حيث التركيب الجزيئي.

التأثير في الجسم الحي لمؤشر كتلة الجسم في نماذج إصابات الكلى الحادة (AKI)

أولاً ، درسنا سلامة BME في الفئران. 

بعد تناول BME عن طريق الفم ، تم جمع عينات الدم من فئران BALB / c وخنازير Bama المصغرة ، وتم قياس مصل alanine aminotransferase و gamma-glutamyl transpeptidase والجلوكوز ومستويات البيليروبين الكلية. 

 لم يؤثر علاج BME بشكل كبير على فهارس الدم هذه ، مما يشير إلى سلامة مرضية لـ BME في الفئران. 

علاوة على ذلك ، تمت دراسة التأثير في الجسم الحي لـ BME في سلسلة من نماذج الفشل الكلوي الفئران ، بما في ذلك AKI الناجم عن السيسبلاتين ، AKI الناجم عن الجنتاميسين ، AKI الناجم عن الجلسرين واضطراب استقلاب الأدينين الذي تسبب في الفشل الكلوي المزمن (CKF) .

والجدير بالذكر أن dysbiosis في الكائنات الحية الدقيقة في الأمعاء يمكن أن يؤدي إلى زيادة خطر الإصابة بأمراض مثل مرض كرون والتهابات الجهاز الهضمي. 

هنا ، درسنا أيضًا التغييرات في ميكروبيوتا الأمعاء بعد العلاجات المختلفة ، كما هو محدد.

 من خلال تحليل المكون الرئيسي ، وجدنا أن الإدارة المباشرة للبكتيريا قد غيرت بشكل كبير بنية ميكروبيوتا الأمعاء. 

بعد تناول البكتيريا ، انخفض غنى الميكروبات في الأمعاء بشكل كبير. 

إجمالاً ، اختفى 80.4٪ من الأنواع مقارنة مع تلك الموجودة في المجموعة التي تتلقى محلول ملحي مخزّن بالفوسفات (PBS) . 

في المقابل ، كان للعلاج BME تأثير ضئيل على تركيبة الكائنات الحية الدقيقة للفئران ، مما يشير أيضًا إلى سلامة أعلى لاستراتيجية العلاج هذه.كثيرا ما تؤدي السمية الكلوية التي تسببها الأدوية السريرية إلى الإصابة بالتهاب المفاصل الروماتويدي. 

هنا ، تم إجراء الحقن تحت الجلد لسيسبلاتين في إناث الفئران BALB / c للحث على AKI. 

حدثت الوفاة لأول مرة في مجموعة PBS 2 d بعد حقن سيسبلاتين ، ومات 60٪ من الفئران خلال 5 أيام. 

في المقابل ، توفي شخصان فقط في المجموعة المعالجة بـ BME أثناء العلاج لمدة 10 أيام .

 تم جمع عينات الدم من الفئران ، وتم الكشف عن مستويات اليوريا في الدم والكرياتينين في الدم.

 لم يلاحظ أي زيادة كبيرة في الكرياتينين في الدم في نموذج AKI هذا. 

ومع ذلك ، لوحظ زيادة ملحوظة في مستويات اليوريا في الدم في PBS- والفئران المعالجة بالبكتيريا. 

ظل تركيز اليوريا في الدم لدى الفئران المعالجة بـ BME في المعدل الطبيعي 

 في اليوم الرابع من العلاج ، كان تركيز اليوريا في الدم في مجموعة BME أقل بكثير من تركيزه في برنامج تلفزيوني (PBS = 0.001) ، وتعطيل BME (P = 0.009) ، والبكتيريا (P = 0.008) والبكتيريا + مجموعات BME فارغة (P = 0.027). 

في اليوم السابع من العلاج ، كان تركيز اليوريا في الدم في مجموعة BME لا يزال أقل بكثير من تركيزه في برنامج تلفزيوني (PBS = 0.001) ، والكبسولة الفارغة (P = 0.005) ، وتعطيل BME (P = 0.001) والبكتيريا + مجموعات BME فارغة (P = 0.022).

كان الإزالة السريعة وفقًا للتقارير السابقة لتنظيم مستقلبات الدم (حمض فينيل بيروفيك والأمونيا) عن طريق امتصاص البكتيريا عن طريق الفم. 

أدى علاج BME بالفعل إلى خفض إنتاج اليوريا وتحسين معدل بقاء الفئران المصابة بـ AKI. 

على الرغم من أن BME والبكتيريا والبكتيريا الفارغة + BME الفارغ كان لها أيضًا تأثيرات علاجية معينة ، فمن الواضح أن BME كان الأفضل في تحطيم اليوريا وإطالة فترة البقاء على قيد الحياة. 

تم اختبار الاختلافات في البقاء على قيد الحياة باستخدام تحليل البقاء على قيد الحياة. وجدنا أن فترة بقاء الفئران المعالجة بـ BME كانت أطول بشكل ملحوظ من تلك التي عولجت بالبكتيريا + كبسولات فارغة (P = 0.0043). أثبتت هذه النتيجة على حد سواء ضرورة وفعالية استراتيجية التغليف.


لم يتم ملاحظة الزيادة في مستويات الكرياتينين في نموذج AKI الناجم عن سيسبلاتين ؛ وبالتالي ، قمنا ببناء نموذج AKI آخر لإجراء تقييم شامل لتأثيرات BME. 

عن طريق الحقن العضلي بنسبة 50 ٪ من الجلسرين ، تم صنع نماذج الفئران من AKI الناجم عن انحلال الربيدات.

 في مجموعة PBS ، مات 50 ٪ من الفئران في غضون 7 أيام 

 كما شهدت الفئران المعالجة بالبكتيريا وفيات متفرقة ، حيث مات ثلاثة من كل عشرة فئران (30٪) خلال 7 أيام من العلاج.

 في مجموعة BME ، نجت جميع الفئران. 

في الوقت نفسه ، تمت الإشارة إلى تأثير BME أيضًا من خلال التغيرات في مستويات اليوريا والكرياتينين في الدم. 

 حافظ علاج BME على تركيزات اليوريا والكرياتينين في الدم في فئران AKI عند مستويات منخفضة ثابتة (اليوريا: ~ 10 ملي ؛ الكرياتينين: ~ 30 ميكرومتر). 

في اليوم الثالث من العلاج ، وصلت تركيزات اليوريا والكرياتينين في مجموعة PBS إلى ذروتها البالغة 35.7 ملي مولار و 254 ميكرومتر على التوالي. ثم ، بعد 7 أيام من حقن الجلسرين ، عادت كل من مستويات اليوريا والكرياتينين إلى وضعها الطبيعي.


في نماذج AKI المذكورة أعلاه ، كان لدى الفئران معدلات وفيات أعلى ، مما أثر على تقييم فعالية BME.

 هنا ، تم إنشاء نموذج AKI الناجم عن الأمينوغليكوزيد عن طريق الحقن اليومي للجنتاميسين داخل الصفاق.

 لم يتحسن مستوى اليوريا في هذا النموذج بشكل ملحوظ .

 ومع ذلك ، بعد الحقن المستمر للجنتاميسين لمدة 8 أيام ، كان تركيز اليوريا في مجموعة برنامج تلفزيوني أعلى أيضًا بشكل ملحوظ من مجموعة BME (P = 0.033). 

في الوقت نفسه ، خفضت معالجة BME متوسط ​​تركيز الكرياتينين من 32 إلى 14.6 ميكرولتر لتر . 

بشكل جماعي ، في ثلاثة نماذج AKI تم تشغيلها بواسطة سيسبلاتين ، الجلسرين والجنتاميسين ، تم إثبات قدرة BME في إزالة النفايات النيتروجينية بشكل جيد.


تميل الحيوانات الكبيرة إلى امتلاك مساحات سطحية أصغر من الحيوانات الصغيرة ، مما قد يؤثر على الكفاءة العلاجية لـ BME.

 درسنا التأثير العلاجي لـ BME في نموذج AKI الخنازير.

 هنا ، تم إجراء الحقن العضلي اليومي للجنتاميسين على خنازير باما المصغرة 3i) . تم إعطاء BME عن طريق الفم للخنازير. 

بعد إعطاء الجنتاميسين ، تم جمع عينات دم الخنازير للكشف عن النفايات النيتروجينية. يمكن ملاحظة زيادة كبيرة في تركيز اليوريا والكرياتينين في الدم في الخنازير غير المعالجة في اليومين 7 و 10 على التوالي

. أدى استخدام BME إلى تثبيط تنظيم مستويات اليوريا والكرياتينين. على الرغم من أن عددًا كبيرًا من البكتيريا (يصل إلى 5 × 1010 وحدات تشكيل مستعمرة (cfu) d − 1) تم أخذها من قبل الخنازير المعالجة بـ BME ، لم يكن هناك فرق كبير في وزنها مقارنة بالخنازير غير المعالجة 

 لم يتأثر الدم ألانين أمينوترانسفيراز ، أسبارتات ترانسبيبتيداز ، غاما جلوتاميل ترانسبيبتيداز ، الجلوكوز ومستويات البيليروبين الكلية بعد علاج BME 


التأثير في الجسم الحي لـ BME في نماذج الفئران CKF

استكشفنا أيضًا تأثير BME في نموذج CKF الفئران. 

هنا ، باستخدام التغذية طويلة الأجل لنظام غذائي عالي الأدينين ، تم تطوير نموذج الفئران لتشوهات التمثيل الغذائي التي تشبه CKF في البشر. 

في تجربة 45 يومًا ، لم يُلاحظ موت حيوانات التجربة في مجموعة غسيل الكلى البريتوني أو مجموعة BME. 

ومع ذلك ، ماتت جميع الفئران غير المعالجة (ن = 8) في غضون 45 يومًا بسبب تطور CKF 

. بعد 21 يومًا من التغذية ، ازدادت تركيزات اليوريا والكرياتينين في الدم بشكل ملحوظ 

. خفض علاج غسيل الكلى البريتوني من تركيز اليوريا في الدم والكرياتينين بنسبة 51 و 23٪ على التوالي.

 وبالمثل ، أدى علاج BME أيضًا إلى خفض تركيز اليوريا والكرياتينين في الدم بنسبة 54٪ و 34٪ على التوالي. 

أظهر هذا الاستنتاج بنجاح أن BME يمكن أن يقلل بشكل فعال من النفايات النيتروجينية في نموذج الفئران CKF. 

تم استخدام التصوير الديناميكي الفلوري للكشف عن الوظيفة الكلوية للفئران بعد علاجات مختلفة.

  زادت إشارة التألق في كليتي BME- أو الفئران المعالجة بغسيل الكلى البريتوني بشكل كبير خلال 5 دقائق. يشير التراكم السريع للسيانين 5.5 (Cy5.5) في الكلى إلى أن علاج BME يمكن أن يحمي وظائف الكلى. 

في المقابل ، لم يتم إثراء الفلورة في كلى الفئران غير المعالجة

يمكن أن يسبب غسيل الكلى طويل الأمد آفات صفاقيّة بسبب الإجراءات الغازية.

 بعد العلاج بغسيل الكلى البريتوني ، تم جمع الصفاق من الفئران ومراقبتها. 

 ، تم العثور على سماكة والتهاب في الصفاق.

 تم إجراء التحليل الباثولوجي أيضًا لفحص الأنسجة المعوية للفئران المعالجة بـ BME. علاج BME لم يسبب التهاب معوي خطير 



في نماذج الفئران AKI و CKF والفشل الكلوي الخنازير ، درسنا بشكل شامل فعالية BME في إزالة النفايات الأيضية. 

في حالة نموذج الفئران CKF ، وجدنا أن كفاءة BME وغسيل الكلى البريتوني كانت متشابهة جدًا. 

جعلت الميزات غير الغازية لعلاج BME أقل احتمالية للتسبب في التهابات جهازية أو التهاب الصفاق مقارنة بغسيل الكلى البريتوني. 

بالإضافة إلى ذلك ، في تجارب السلامة مع الفئران والخنازير ، لم يُظهر BME آثارًا جانبية حادة.

 للبكتيريا مسارات متعددة الاستخدامات في عملية التمثيل الغذائي ، ويمكن توسيع أنواع النفايات القابلة للتحلل بواسطة الميكروبات الاصطناعية بعد مزيد من فحص الإجهاد. 

وفي الوقت نفسه ، يمكن أيضًا إضافة البروبيوتيك الواقية إلى BME لإضعاف تلف الكلى وتنقية النفايات الأيضية في نفس الوقت. 

اعتمادًا على خصائص الأنواع المختلفة من الفشل الكلوي ، يمكن الجمع بين البكتيريا ذات الخصائص والوظائف الأيضية المختلفة لتحقيق علاجات مخصصة. 

يمكن تطوير هذه الاستراتيجية إلى تقنية للتآزر مع غسيل الكلى وتقليل كل من وتيرة ووقت غسيل الكلى. 

ومع ذلك ، لا تزال هناك بعض المشكلات المتعلقة بآلية العلاج المحددة والسلامة التي تحتاج إلى معالجة في مزيد من الدراسات. 

الأهم من ذلك ، بالاستفادة من القدرة العالية على التحكم والاستجابة الذكية للمواد الاصطناعية ، لا يزال هناك مجال واسع لتحديث العلاجات الحالية القائمة على الميكروبيوم لعلاج أمراض التمثيل الغذائي غير الفشل الكلوي.


طرق

المواد

تم شراء اليوريا ، والكرياتينين ، وكبريتات الجنتامايسين ، وثاني كلوريد cis-diammineplatinum ، وألجينات الصوديوم ، والبولي (حمض الأكريليك) ، والبولي (إيثيلين إيمين) ، وفلوريسئين أيزوثيوسيانات ، ورودامين أيزوثيوسيانات ، وبولي فينيل بيروليدون ، وكاربوكسي ميثيل السليلوز وبينازيبريل HCl. تم شراء NH4Cl و CaCl2 و glycerol و PEG2000 و PEG800 من Sinopharm Chemical Regent. تم شراء PEG8000 و BSA و Pluronic F-127 وهيدروكلوريد الدوبامين من Sigma-Aldrich Chemical. 

تم شراء مجموعة فحص البروتين BCA من Thermo Fisher Scientific.

 تم شراء مجموعة اختبار اليوريا من Nanjing Jiancheng Chemical Regent. تم شراء Cy5-NHS و Cy5.5 من Yuanye Biological Technology.


الأجسام المضادة

تم شراء الأجسام المضادة متعددة النسيلة المضادة لـ TNF-α (ab6671) من Abcam. تم شراء الأجسام المضادة متعددة الأضداد المضادة لـ IL-6 (GB11117) من Servicebio.


سلالات بكتيرية

تم الحصول على E. coli (سلالة MG1655) و Bacillus subtilis (1.821) من مركز مجموعة الثقافة الميكروبيولوجية العامة في الصين. 

تم الحصول على Lactobacillus acidophilus (CCTCC AB 96031) من المركز الصيني لمجموعة ثقافة النوع.


التخصيب البكتيري من عينات براز الفئران

تم تحضير الوسائط الانتقائية عن طريق استبدال مصدر النيتروجين (كلوريد الأمونيوم ، 1 جم لتر) من الوسط الأدنى M9 إما باليوريا (1.3 جم لتر) أو الكرياتينين (1 جم لتر). 

تم جمع عينات براز من أربعة أنواع مختلفة من الفئران (BALB / c و ICR و C57BL / 6J و C3H).

 تم تشتيت كل 0.1 جرام من البراز في 10 مل من برنامج تلفزيوني ثم تجانسه بالموجات فوق الصوتية (Shumei KQ-300DE ؛ 70٪ طاقة ؛ 3 دقائق). 

تم تخفيف كل مادة طافية 100 ميكرولتر في 10 مل M9 متوسطة أو وسائط انتقائية. 

تمت زراعة البكتريا السائلة للبكتيريا البرازية عند 37 درجة مئوية وتمريرها كل 24 ساعة للقضاء على البكتيريا غير القادرة على الاستفادة من مصادر النيتروجين ؛ بعد ذلك ، تم وضع خط الثقافة على سطح وسط أجار LB المتصلب باستخدام حلقة اللهب. 

تم تلقيح المستعمرات المفردة وحفظها في وسط M9 متوسط ​​أو انتقائي. في 24 ساعة بعد المرور ، لكل مستعمرة نمت ، تمت إضافة ما يقرب من 107 بكتيريا إلى 10 مل من الوسط الانتقائي المقابل أو متوسط ​​الحد الأدنى M9. 

بعد ذلك ، تم قياس تركيزات المركبات المحتوية على النيتروجين في نقاط زمنية مختلفة بعد إضافة البكتيريا.

 تم تحديد تركيزات اليوريا والأمونيا باستخدام طريقة اليورياز ، وتم تحديد تركيز الكرياتينين باستخدام طريقة أوكسيديز الكرياتينين.

 في 24 ساعة ، تم جمع وسط الثقافة لقياس محتويات الأحماض الأمينية. تم إجراء التحليل باستخدام محلل الأحماض الأمينية (Hitachi L-8900). بعد ذلك ، تم اختيار السلالات البكتيرية الثلاث ذات القدرات الأفضل لاستهلاك اليوريا والكرياتينين والأمونيا وتسميتها بالسلالة 1 والسلالة 2 والسلالة 3 على التوالي

قدرة السلالات البكتيرية على تحلل المخلفات النيتروجينية

تم خلط السلالة 1 والسلالة 3 بنسبة 1: 1 ، ثم تمت إضافة 5 × 107 بكتيريا إلى وسط انتقائي 10 مل (اليوريا ، 1.3 جم لتر -1). تم قياس تركيزات اليوريا والأمونيا في الوسط عند 0 ، 1 ، 2 ، 4 ، 6 ، 8 ، 12 و 24 ساعة بعد إضافة البكتيريا.


تم خلط السلالتين 2 و 3 بنسبة 1: 1 ، ثم تمت إضافة 5 × 107 بكتيريا إلى وسط انتقائي 10 مل (كرياتينين ؛ 1 جم لتر -1). تم قياس تركيزات الكرياتينين والأمونيا في الوسط عند 0 ، 1 ، 2 ، 4 ، 6 ، 8 و 12 ساعة بعد إضافة البكتيريا.


تحسين خلط البكتيريا

تم تحضير خليط جرثومي ثلاثي من 36 نسبة ، حيث شكلت كمية كل سلالة 10-80٪. تمت إضافة كل قسمة من بكتيريا 5 × 107 تتكون من ثلاث سلالات بالنسبة الموضحة أعلاه إلى وسط انتقائي 10 مل (اليوريا: 1.3 جم لتر − 1 ؛ الكرياتينين: 1 جم لتر) 1). تم قياس تراكيز اليوريا والكرياتينين والأمونيا في الوسط عند 8 ساعات بعد إضافة الخليط البكتيري.


تحضير البكتيريا @ MSs و BME بواسطة ميكروفلويديكس

تمت الإشارة إلى تحضير المجهرية الجينات الكالسيوم في الأدبيات السابقة. باختصار ، تم أكسدة الجينات ببيودات الصوديوم (2٪) بعد المعالجة بالفحم. 

تم استخدام رقاقة مولدة للقطيرات من النوع T (عمق القناة: 100 ميكرومتر) مع زجاج كاره للماء لصنع كريات مجهرية أحادية التشتت ؛ تم استخدام 10٪ سبان 80 كمرحلة مستمرة ؛ ومزيج من ثلاث سلالات بكتيرية (البكتيريا: 108 cfu. ml 1 ؛ سلالة 1: سلالة 2: سلالة 3 = 3: 3: 4) ومحلول ألجينات (1٪) كمرحلة مائية داخلية.

 كان معدل تدفق الألجينات 5 ميكرولتر دقيقة ، وكان معدل تدفق الطور النفطي 10 ميكرولتر دقيقة. 

تم استخدام مضخة حقن مكروي للتحكم في سرعة التدفق.

 بعد تكوين القطرات ، تم استخدام محلول CaCl (50 ملي مولار) لجمع وتثبيت الكرات المجهرية في درجة حرارة الغرفة. للتحضير على نطاق واسع ، يمكن تحضير الكرات المجهرية باستخدام طريقة الرش.

 تم رش محلول ألجينات الصوديوم المشتت للبكتيريا (1٪) في محلول كلوريد الكالسيوم (1٪) من خلال مرذاذ ميكانيكي.

 تم تركيز المجهرية المحضرة بالطرد المركزي (954 جم ؛ 3 دقائق). تم غسل الكرات المجهرية بـ PBS مرتين قبل تغليفها بـ PDA. 

تم غسل الكرات المجهرية مرتين باستخدام PBS ثم حضنت بشكل مشترك باستخدام 0.1 مجم مل من الدوبامين عند درجة الحموضة 8.5 لمدة 10 دقائق. تمت إضافة حمض الهيدروكلوريك لضبط قيمة الأس الهيدروجيني إلى 6 ، لإنهاء طلاء PDA للحصول على 

BME. تم تركيز BME عن طريق الطرد المركزي

تمت زراعة BME المعدل بالفلورسين مع RhB (1 مجم مل) والبوليمرات الأخرى التي تحمل علامة RhB (1 مجم مل) لمدة ساعتين. بعد ذلك ، تم طرد BME (954 جم ؛ 3 دقائق) وغسلها بالماء منزوع الأيونات ثلاث مرات.

 تم إعادة تعليق BME في الماء منزوع الأيونات. تم إسقاط التعليق بين غطاءين. تم استخدام مجهر مضان مقلوب لمراقبة التألق الأخضر لـ BME والوميض الأحمر للبوليمرات.


نموذج إصابة الكلى الحادة التي يسببها سيسبلاتين

تمت الموافقة على البروتوكولات التجريبية من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية التابعة لمركز التجارب الحيوانية بجامعة ووهان (ووهان ، الصين). 

تم تنفيذ جميع الإجراءات التجريبية على الحيوانات وفقًا للوائح إدارة الشؤون المتعلقة بالحيوانات التجريبية التي وافق عليها مجلس الدولة لجمهورية الصين الشعبية. 

تم تقسيم الفئران الإناث BALB / c البالغة من العمر ستة أسابيع بشكل عشوائي إلى ثلاث مجموعات.

تلقت جميع الفئران حقنة واحدة من السيسبلاتين (12.7 مجم كجم -1 تحت الجلد) مذابة في محلول ملحي معقم 0.9٪ في اليوم 0. من اليوم الأول إلى اليوم العاشر ، تلقت الفئران في مجموعات مختلفة تسريب BME (1 × 108 cfu لكل الماوس ، الإدارة داخل المعدة (ig)) ، خليط البكتيريا (السلالة 1: السلالة 2: السلالة 3 = 3: 3: 4 ؛ 1 × 108 cfu لكل فأر ، ig) أو PBS ، على التوالي. في الأيام 1 و 4 و 7 و 10 ، تم أخذ دم من وريد الذيل لقياس تركيز اليوريا باستخدام طريقة اليورياز.

 وفي الوقت نفسه ، تم تسجيل منحنى البقاء.


نموذج AKI الفئران التي يسببها الجلسرين

تم تقسيم الفئران الإناث BALB / c البالغة من العمر ستة أسابيع بشكل عشوائي إلى ثلاث مجموعات.

 تلقى كل منهم جرعة واحدة من خليط الجلسرين والماء بنسبة 50٪ في اليوم 0 (10 مل كجم في العضل). 

من اليوم الأول إلى اليوم السابع ، تلقت الفئران في ثلاث مجموعات علاجات بنفس الجرعة والجدول الزمني مثل نموذج CKF المستحث بالسيسبلاتين. 

في الأيام 0 و 1 و 2 و 3 و 7 ، تم أخذ الدم من قلوب الفئران لإجراء فحوصات كيميائية حيوية. تم قياس تركيز اليوريا في الدم والكرياتينين. 

وفي الوقت نفسه ، تم تسجيل منحنى البقاء

نموذج CKF الناجم عن الأدينين

تم تقسيم الفئران الذكور البالغة من العمر ستة أسابيع بشكل عشوائي إلى ثلاث مجموعات.

 كلهم تلقوا نظامًا غذائيًا عالي الأدينين لمدة تصل إلى 6 أسابيع (0.25٪ أدينين في العلف ؛ وزن / وزن). 

تم أخذ عينات الدم من قلوب الفئران لإجراء فحوصات الكيمياء الحيوية كل أسبوع ، وتم استخدام الأفراد ذوي الحالة الأفضل لأخذ الدم. 

من اليوم 22 ، تلقت الفئران في مجموعة BME (1 × 108 cfu لكل فأر ، أي) علاج BME كل يومين. 

تم إعطاء الفئران في مجموعة غسيل الكلى البريتوني عن طريق غسيل الكلى البريتوني مع ديالة منخفضة الكالسيوم كل يوم (3 مل لكل فأر داخل الصفاق). وفي الوقت نفسه ، تم تسجيل منحنى بقائهم.


التأثير العلاجي في الجسم الحي لـ BME في نموذج AKI الخنازير

تم تقسيم ستة إناث من خنازير باما الصغيرة (عمرها شهرين) بشكل عشوائي إلى مجموعتين ، وتم حقنها جميعًا بالجنتاميسين (80 مجم / كجم داخل الصفاق) كل يوم ؛ بعد 12 ساعة ، تمت معالجة الخنازير باستخدام BME (5 × 1010 قدم مكعب كجم × 1 عن طريق الفم). 

تم إجراء علاج BME كل يوم. تم جمع عينات دم من الخنازير لقياس النفايات النيتروجينية في الأيام 0 و 1 و 4 و 7 و 10.


تعليقات
ليست هناك تعليقات
إرسال تعليق

إرسال تعليق

الاسمبريد إلكترونيرسالة

Recent Posts
آخر الأخبار
أحدث المواضيع
Comments
Gallery
Featured Posts
Videos
Recent Posts
Recent in Sports
Column Right
Feat
Carousel
Column Left
Featured
Breaking News
الرئيسية
//cdrvrs.com/4/4373597